EQUIPO 9

La clula es el componente bsico y funcional de todos los seres vivos El cido desoxirribonucleico Contiene la informacin gentica usada en el desarrollo y el funcionamiento de los organismos vivos, siendo el responsable de su transmisin hereditaria.

FUENTES DE DAO AL ADN

Endgenos (mutaciones espontaneas)

Por especies reactivas de oxgeno (Eros) radicales reactivos del oxigeno.

Lesiones Hidrolticas Exgenos (mutaciones Inducidas)

Radiacin UV (200-300nm)
Rayos X, Rayos Gamma, etc. Qumicos mutagnicos Quimioterapia, radioterapia (tratamiento de cncer)

Fuente Exgena.

1) Radiaciones
a) Ionizantes b) Luz UV.

2) Sustancias Ambientales.
a) Mgatenos (agentes qumicos). Alquilacin. Oxidacin. b) Virus.

Dao por Luz UV.

Dmero de Timina

Fuente Exgena.

Fuente Exgena.

Dao por Luz UV

Cncer de piel.

Fuente Exgena.

Dao por Radiaciones.

Porcentaje de Exposicin a radiaciones Ionizante

Fuente Exgena.

Dao por Oxidacin

Fuente Exgena.

Dao por Oxidacin

Xantatos

Fuente Exgena.

Dao por Alquilacin (metilacin)

7-metilguanina

Fuente Exgena.

Dao por Alquilacin

Nitrosamina

Fuente Endgena.
1. Depurinacin.
2. Desanimacin. 3. Especies de Oxigeno Reactivo.

4. Errores Replicacin de DNA.

5. Errores en Replicacin y Recombinacin.
*Producen mutaciones Espontaneas.

Fuente Endgena.

Dao por desanimacin.

Fuente Endgena.

Dao por depuracin.

A medida que la clula envejece, la tasa de reparaciones de ADN decrece hasta que no puede mantener el ritmo de los daos al ADN. La clula pasa a uno de estos destinos:

1. Un estado irreversible de inactividad, llamado senescencia. 2. Suicidio celular, llamado apoptosis o muerte celular programada. 3. Carcinognesis, o formacin de cncer.

La tasa de mutacin espontanea natural, es alrededor de 0.1 a 1 mutacin por gen por milln de gametos en c/generacin. 50 % de los productos de los embarazos mueren debido a factores genticos. La mayora de los mecanismos de reparacin del DNA implican la eliminacin de nucletidos.

OXIDACIN
Debido a que las clulas no utilizan todo el oxgeno que les llega, se sabe que aproximadamente un 2 % de ese oxgeno se convierte en formas qumicas nocivas que se denominan

EROs.

radicales libres o

Gran parte de las reaccin de oxidacin es por fuentes exgenas, como la radiaciones ionizantes.

Radical libre:

Especies qumicas que poseen en el ltimo orbital un electrn no apareado, por lo que, son capaces de extraer un electrn de las molculas vecinas para completar su orbital, convirtindose en componentes altamente reactivos y oxidantes.

Reaccionan instantneamente con otras sustancias que estn cercanas provocando un gran dao a las molculas bsicas, en la vida de la clula.

La interaccin con radicales libres del oxgeno pueden provocar: Rompimiento de la cadena de ADN.

Modificacin de las bases.

Uniones cruzadas ADN-ADN o ADN-protena. Y a largo plazo apoptosis de la clula o carcinognesis.

Estrs Oxidativo

El estrs oxidativo es causado por un desequilibrio entre la produccin de oxgeno reactivo y la capacidad de un sistema biolgico de combatir rpidamente los reactivos intermedios o reparar el dao resultante.
Hay una disminucin de los sistemas de defensa, lo que resulta en una mayor concentracin de Especies Reactivas de Oxgeno (EROs) . Es en esta situacin en la que se manifiestan las lesiones que producen los radicales libres.

En la actualidad se sabe que varias clases de clulas producen cantidades elevadas de EROs Fagocitos, como los macrfagos y los neutrfilos buscan microorganismos y clulas daadas En un proceso que consume oxigeno (estallido respiratorio), se generan las EROs que se utilizan para destruir y desmantelar estas clulas

Especies reactivas de oxgeno

La primera EROs que se forma durante la reduccin del oxgeno es el radical superxido O-2, produce dao componentes fosfolipdicos de las membranas

El perxido de hidrogeno reacciona con el Fe2+(o con otros metales de transicin) originan la produccin del radical hidroxilo (OH), una especie muy reactiva, pueden iniciar una reaccin autocataltica de radicales en cadena.

El oxigeno singlete (1O2), un estado excitado del dioxgeno en el que los electrones apareados se han desapareado, puede formarse a partir de un superxido o a partir de perxidos. Es especialmente daino para compuestos aromticos y para alquenos conjugados.

Especies reactivas de nitrgeno

Tambin se pueden clasificar dentro de la EROs .

xido ntrico (NO)

Dixido de nitrgeno (NO2) Peroxinitrilo (ONOO-)

Estos reaccionan qumicamente con

lpidos,
protenas, carbohidratos ADN al interior de las clulas El estrs oxidativo contribuye al desarrollo de enfermedades degenerativas tales como:

Arterosclerosis
Cncer Infarto al miocardio Hipertensin Enfermedades Neurolgicas (Parkinson y Alzheimer)

Definicin es una sustancia capaz de neutralizar la accin oxidante de los radicales libres.

Algunos antioxidantes destacados son el -tocoferol (vitamina E), el cido ascrbico (vitamina C) y el caroteno. El -tocoferol, un potente eliminador de radicales, pertenece a una clase de compuestos que se denominan antioxidantes fenlicos. Se encuentran en los vegetales, en los aceites de semillas, en los cereales enteros y en los vegetales de hojas verdes, desempea una funcin importante en la proteccin de la membrana de los radicales peroxilio lipdicos

El -caroteno es un miembro de los carotenoides, se encuentra en las frutas de color amarillo-naranja y verde oscuro y en los vegetales como las zanahorias, las papas y el brcoli, es un antioxidante importante de las membranas. El cido ascrbico elimina varias EROs dentro de los compartimentos acuosos de la clula y en los lquidos extracelulares.

Electroforesis unicelular alcalina o Ensayo cometa

Es una tcnica muy sensible que permite estudiar diferentes agentes genotxicos in vivo e in vitro, por medio de la migracin del ADN de clulas individuales sometidas a un campo elctrico.
til en toxicologa, carcinognesis, envejecimiento celular, investigaciones de reparacin celular, etc.

Antecedentes
Rydberg y Johanson en 1978.
1. Clulas embebidas en agarosa sobre un portaobjetos 2. Lisis en condiciones de alcalinidad 3. Tincin con naranja de acridina

- Se observaba y se media el radio de fluorescencia de color rojo y de color verde. El radio de fluorescencia era mayor en las clulas con el ADN daado.

stling y Johanson en 1984.

Introducen una tcnica microelectrofortica conocida como ensayo de EUG o ensayo cometa. 1. Clulas embebidas en agarosa sobre un portaobjetos 2. Lisis con detergentes y altas conc. de sales.

3. Electroforesis en condiciones neutras.

4. Tincin con bromuro de etidio.

Las clulas con aumento en el dao muestran un incremento en la migracin del ADN hacia el nodo.

DESVENTAJA

Singh y colaboradores en 1988.

Introducen una tcnica microelectrofortica bajo condiciones alcalinas.

Es posible detectar rompimientos francos, sitios sensibles al lcali y enlaces entrecruzados de ADN. Deteccin de rompimiento de cadena doble y la deteccin de rompimiento de cadena sencillas, por lo que presenta mayor sensibilidad.

En que consiste
Clulas embebidas en agarosa sobre un portaobjetos se lisan con detergentes y alta concentracin de sal para formar los nucleoides que contienen asas sper enrolladas de ADN unidas a la matriz nuclear.

Si estos se someten a electroforesis alcalina (pH > 13) el resultado es muy similar a los cometas y se visualizan por microscopia de fluorescencia .

Ventajas
Alta sensibilidad.

Datos de clulas individuales y en cualquier tipo de clulas eucariontes.

Requiere de cantidades mnimas de muestra.

Relativamente fcil y se obtienen resultados en poco tiempo.

Permite detectar dao gentico in vitro o in vivo.

Variables que afectan la sensibilidad

La concentracin de agarosa.
Composicin de la solucin de lisis. La composicin y pH del amortiguador de electroforesis. Condiciones de electroforesis (volteje, amperaje y duracin).

VIABILIDAD CELULAR
Tice y colaboradores en 1996.
Usando colorantes fluorocromados (bromuro de etidio y 5-6 diacetato de carboxifluorescena)

Se resuspende 10L del botn celular en 10 L de solucin de flurocromos.

5 minutos de incubacin , 3 lavados con 1mL de medio de cultivo.

Analizar en microscopio de fluorescencia con un filtro de excitacin de luz de 450-490nm Evaluar 200 clulas. Clulas viables (verde) y no viables (rojo).

Reactivos usados
Reactivo Perxido de Hidrgeno Bromuro de Etidio Funcin que desempea Dao Celular Colorante Fluorocromado Accin que produce Oxidacin Metaboliza 5,6 acetato de carboxifluorocena a un derivado que tie el citoplasma verde en clulas vivas y rojo en clulas no vivas

Solucin de Lisis Buffer de Corrimiento pH 13 Buffer Neutralizante pH 7.5 Agarosa

Lisa las clulas Desenrrollamiento del ADN Neutraliza y detiene la reaccin alcalina Medio de difusin y anclaje de las clulas

Preparacin de Muestra
10L de Sangre 75L de Agarosa de Bajo punto de Fusin

Gel de agarosa regular

75L de Agarosa Bajo punto de fusin

Solucin de Lisis fra

Control Positivo
0.5mM 30 Sumergido en Agua Fra 75L de Agarosa Bajo punto de fusin 3 a 3000rpm

Solucin de Lisis fra

1 Hora a 40C Despus

Electroforesis

Retirar con cuidado los portaobjetos y lavar 3 veces con Buffer de Neutralizacin
Metanol absoluto 5

Buffer pH 13 25 volts 13 miliampers 20 minutos Protegido de la luz

Tincin con bromuro de etidio

Filtro de excitacin 515-560nm Aumento 40X

Medicin

Interpretacin
Tomando en cuenta las estelas de los cometas y el ncleo Grado de dao del ADN: Criterios de Anderson
No dao: Menos del 5% Dao Bajo: 5-20 % Dao Medio: 21-40% Dao Alto: 41-95% Dao Total: Ms del 95%

Criterios de Anderson

Grado de Dao

Ejemplo
CLULA LONGITUD TOTAL (micras ) 25 25 25 LONGITUD DEL NCLEO (micras) 12.5 12.5 5 12.5 12.5 17.5 30 10 15 15 LONGITUD DE LA COLA (micras) DAO (%) 12.5 12.5 15 7.5 12.5 15 2.5 12.5 15 10 50 50 60 37.5 50 46 7.69 55.5 50 40

CON DAO

20 25 32.5 32.5 22.5 30 25

Promedio del Grado de Dao Celular = 44.6

Referencias
Alberts B, Bray D, Hopkin K, Johnson A, Lewis J, Raff M et al. Introduccin a la biologa celular. 2a ed. Madrid: Medica Panamericana; 2006. Benjamin L. Genes. 2a ed. Espaa: Revert; 1996. Cortes Barberena E. Deteccin del dao en el ADN por medio de electroforesis unicelular en clulas de ratas desnutridas experimentalmente durante la lactancia. [Tesis Maestra]. Mxico; 1997. Jimenez GL, Merchant LH. Biologa celular y molecular. Mxico: Pearson Education; 2003.

Pedroza Roldn C, Bojrquez Rangel Guillermo. Evaluacin de la genotoxicidad del perxido de hidrgeno y de luz UV en linfocitos humanos mediante electroforesis unicelular alcalina (Ensayo Cometa). Expresiones medicas (Mex) 2003; 2: 26-29.