INSTITUTO TECNOLOGICO DE LA CUENCA DEL PAPALOAPAN

TEMA: 3.2 TECNICA DE LABORATORIO Y MICROTECNIA(FIJACION,INCLUSION,TINCION,DESHID RATADO,ACLARAMIENTO Y MONTAJE )

CATEDRATICO :MANCILLA MORENO MARIO EQUIPO: 4 INTEGRANTES :FELIPE LOPEZ WENDY YAREIH HERNANDEZ HERNANDEZ JULIO CESAR HERNANDEZ HERNANDEZ FELIPE DE JESUS SABINO BAUTISTA ROSALINA DOMINGUEZ SARMIENTO FELIPE EMANUEL SANCHEZ BARRADAS SILVIA

TECNICAS DE MONTAJE

CARACTERISTICAS GENERALES
Las bacterias , junto con los protozoarios, algas microscpicas, hongos microscpicos (incluyendo levaduras) y virus, constituyen los llamados microorganismos. El trmino microorganismos no tiene un significado taxonmico preciso sino que agrupa a todos los organismos de dimensiones microscpicas (< 0.1mm) aunque presenten grandes diferencias entre si. As por ejemplo incluye organismos procariotas (bacterias), eucariota (hongos, protozoarios, algas) y virus. Tambin difieren notablemente en el tamao aunque sean todos microscpicos; en una escala comparativa tenemos: Protozoarios levadura bacterias - virus

BACTERIAS
Aunque existen miles de especies de bacterias diferentes, los organismos individuales presentan una de las tres formas generales siguiente: Elipsoidal o esfrica Cilndrica o en forma de bastn Espiral o helicoidal La bacterias esfricas o elipsoidales se denomina COCOS. Muchas bacterias con esta forma presentan modelos de agrupacin que derivan de los diversos planos de divisin celular. As tenemos: Cocos en pares (diplococos)..Ej. Neisseria Cocos en cadena.Ej. Streptococcus Cocos en racimo..Ej. Staphylococcus Cocos en ttradasEj. Pediococcus Cocos en cubo.Ej. Sarcina Cocos sin distribucin especial

Las clulas bacterianas cilndricas se denominan BACILOS o BASTONES y presentan otros modelos de agrupacin. As tenemos: Bacilos en cadenaEj Bacillus Bacilos en empalizadasEj. Corynebacterium Bacilos sin distribucin especial Las bacterias helicoidales se presentan en general como clulas individuales, independientes; pero las clulas de las distintas especies presentan notables diferencias de longitud, nmero y amplitud de las espiras y rigidez de la pared.

CLASIFICACION
PRINCIPALES CARACTERISTICAS DE LOS MICROORGANISMOS Para proceder a identificar y clasificar a un macroorganismo, deben determinarse, con cierto grado de precisin, las caractersticas del mismo. Entre ellas, las principales son las siguientes:

Caractersticas de Cultivo: las sustancias nutritivas necesarias para el desarrollo y las condiciones fsicas de un medios que lo favorezcan .
Caractersticas morfolgicas: el tamao de las clulas, su forma de agrupacin, diferenciacin en tintura e identificacin de estructuras. Caractersticas metablicas: la manera por la cual los microorganismos llevan a cabo los procesos qumicos biolgicos

Caractersticas de la composicin bioqumica: la identificacin de las principales caractersticas de los componentes qumicos de la clula. Caractersticas antignicas: la deteccin de componentes celulares especiales (qumicos) que dan prueba de similitud entre las especies. Caractersticas genticas: el anlisis de la composicin del acido desoxirribonucleico (ADN) as como la determinacin de la reaccin que ocurre entre material ADN a partir de diferentes microorganismos.

Taxonoma, nomenclatura y clasificacin

Taxonomia es un termino que se relaciona con la Sistemtica, y se refiere a la clasificacin o agrupamiento sistemtico de los organismos en grupos o categoras llamados taxa. La taxonoma se divide en tres partes: Clasificacin: el agrupamiento ordenado de unidades en grupos dentro de unidades mayores. Nomenclatura: la denominacin de las unidades definidas (caractersticas) y por la clasificacin. Identificacin: Haciendo uso del criterio establecido por la clasificacin y nomenclatura mencionados, los microorganismos se identifican comparando las caractersticas de las unidades desconocidas y las conocidas.

PRINCIPIOS DE NOMENCLATURA
Los cdigos zoolgicos, botnicos y bacteriolgico se basan en determinados principios comunes; algunos de los mas importantes son los siguientes: Cada clase distinta de organismos se designa como una especie.

Las especies se nombran por vocablos latinos para ajustarse a una denominacin internacional caracterstica (sistema binominal de nomenclatura)
La aplicacin de los nombres esta reglamentada. Una ley de prioridad asegura el uso del nombre legitimo mas antiguo disponible. Se requiere la designacin de categoras para clasificar los organismos. Se establecen criterios para la publicacin efectiva de nuevos nombres especficos, as como una gua para acuar los nuevos.

NOMBRES CIENTIFICOS DE LAS BACTERIAS

Las bacterias de cada clase distinta se reconoce como una especie (plural especies). Segn el sistema binomial de nomenclatura, cada especie recibe un nombre formado de dos palabras, por ejemplo, Bacillus subtilis. La primera palabra del nombre es el gnero (plural gneros) y siempre se escribe con mayscula. La terminacin del nombre genrico gramatical de la especie debe concordar con l y siempre con bastardilla. Ejemplos: Bacillus (masculino): bastoncito Lactobacillus (masculino): bastoncito de la leche Sarcina (femenino): paquete o manojo

Algunos ejemplo de gneros bacterianos de origen griego alterado para uso latino son: Micrococcus (masculino): grano pequeo Clostridium (neutro): un huso pequeo. Corynebacterium (neutro): bastoncito en masa. Ejemplos de gneros bacterianos asignados en honor de personas y latinizados son:

Pasteurella (femenino): por Louis Pasteur Erwinia (femenino): por Edwin F.Smith, precursor de la patologa de las plantas en Amrica. Neisseria (femenino): por Albert Neisser, descubri el microorganismo que causa la gonorrea.

La segunda palabra del nombre de una bacteria se escribe con letra minsculas y suele ser descriptivo. Un adjetivo que modifica al nombre: Staphylococcus albus (Estafilicoco blanco). Un adjetivo en forma de participio activo de un verbo: Clostridium dissolvens (Clostridio disolvente). Un nombre en posesivo que modifica el nombre genrico: Samonella pullorum ( Salmonela de los pollos) Un nombre en oposicin, un nombre explicativo: Bacillus radicicola (Bacilos que habita en la raz) Se puede aadir el autor del nombre de la bacteria, como en Bacillus coagulans (Hammer) En ocasiones es conveniente subdividir una especie en variedades, como en el caso de que haya diferencias reconocidas dentro de las clasificacin en una nueva especie. Una cepa de Srteptococcus lactis que produce un sabor de malta se designa Srteptococcus lactisvar. maltigenes

NOMBRE COMUNES DE LAS BACTERIAS

Gonococo....Neisseria gonorrhoeae Bacilo tuberculoso..Mycobacterium tuberculosis Bacilo diftrico.Corynebacterium diphteriae Bacilo tfico.Salmonella typhi

METODO DE DIAGNOSTICO
Los mtodos de diagnstico empleado en cualquiera de las ramas de la bacteriologa, virologca, micologa, protozoologa o helmintologa pueden ser agrupados en dos grandes grupos que son los mtodos de diagnostico directo y los mtodos de diagnostico indirecto.

METODOS DE DIAGNOSTICO DIRECTO

Son procedimientos que permiten demostrar la presencia del agente infeccioso en cualquiera de sus etapas morfolgicas. Estos dos mtodos pueden ser: 1. Macroscpicos: solo se utilizan para el diagnstico de vermes adultos y artrpodos. 2. Microscpicos: comprende cualquiera de los exmenes hecho con la ayuda del microscopio sea en materiales frescos o coloreados. 3. Cultivo: son ms usados en los captulos de bacterias y de hongos. Permiten aumentar el nmero de grmenes cuando ellos son muy escasos y estudiar adems sus propiedades culturales y bioqumicas.

4. Inoculaciones: pueden ser a veces los procedimientos ms fciles o ms rpidos para lograr el diagnstico de algunos agentes infecciosos. 5. Estudios Histopatolgico: el material se obtiene por puncin, biopsia o necropsia. 6. Xenodiagnstico: se utiliza, por ejemplo, en diagnstico de Tripanosoma cruz.

METODOS DE DIAGNOSTICO INDIRECTO

Son procedimientos que no muestran en ningn momento el agente que se investiga, sino las reacciones que producen en el organismo atacado. Los mtodos pueden ser especficos e inespecficos. Inespecficos: el hemograma y la eritrosedimentacion proporcionan datos de mucho valor presuntivo en el diagnostico de determinadas enfermedades. Especficos: se basan en el estudio de las reacciones celulares y humorales inmunolgicas, pueden diagnosticar en forma directa el agente que las ocasiono. Los procedimientos especficos pueden ser: pruebas inmunoalrgicas que utilizan antgenos bacterianos totales o fraccionados, para detectar especialmente inmunidad celular y pruebas serolgicas basadas en fenmenos que demuestran la unin especifica del antgeno con el anticuerpo (Fijacin de complemento hemaglutinacion, lisis, precipitacin, inmunofluorescencia, neutralizacin de virulencia, radioinmunoensayo, ELISA, ETC.)

EXAMEN EN FRESCO
Las preparaciones en fresco son preferibles en las situaciones siguientes: 1. La morfologa de las bacterias en espiral se altera mucho cuando se desacan y tien; deben, por lo tanto, examinarse en estado vivo. 2. Cuando las bacterias se observan para determinar si o no mviles. 3. Para observar los cambios citolgicos que ocurren durante la divisin celular y determinar la velocidad en que ocurren. 4. Por este mtodo se observan fcilmente algunas inclusiones celulares como vacuolas y materias grasa.

PREPARADOS FIJOS Y TEIDOS

Para observar las caractersticas morfolgicas de las bacterias, las preparaciones fijas y teidas son las que se usan con mayor frecuencia. a) Las clulas son visibles mas claramente despus de teidas y b) En las preparaciones teidas las diferencias entre clulas de especie diferentes y dentro de la misma especie se demuestra mediante soluciones colorantes apropiadas (tincin diferencial o selectiva). Los pasos esenciales en la preparacin de un fijo y teido son: a) Hacer el frotis o pelcula b) La fijacin y c) La aplicacin de una o ms soluciones colorantes.

Fijacin
Las clulas teidas que se observan con un microscopio deben parecerse la mas posible a las clulas vivas. La fijacin es el proceso por el cual se conservan y fijan en su posicin las estructuras internas y externas de las clulas de los microorganismos. Inactiva enzimas que podran alterar las morfologa celular y endurece las estructuras celulares, de manera que no cambian durante la tincin ni la observacin. Normalmente, durante la fijacin se mata al microorganismos y se fija firmemente al portaobjetos.

Fundamentalmente, existen dos clases de fijacin diferencial: 1. Los bacterilogos fijan con calor frotis bacterianos calentando suavemente a la llama una pelcula de bacterias secada previamente al aire. Este mtodo conserva adecuadamente la morfologa general, pero ni las estructuras internas de la clula. 2. Sin embargo, para proteger las subestructura fina y la morfologa de microorganismo delicados de mayor tamao hay que utilizar la fijacin qumica. Los fijadores qumicos penetran en las clulas y reaccionan con componentes celulares, normalmente protenas y lpidos, para inactivarlos y convertirlos en insolubles e inmviles.

COLORANTES MICROBIOLGICAS
Los numerosos tipos de colorantes empleados para teir microorganismos poseen dos caractersticas en comn: Todos poseen grupos cromforos , grupos con dobles enlaces conjugados que dan el color al colorante. Pueden unirse a las clulas mediante enlace inicos, covalentes o hidrfobo. Por ejemplo, un colorante cargado positivamente se une a estructuras cargadas negativamente de la clula. Los colorantes ionizables se pueden dividir en dos clases generales, tomando como base la naturaleza de su grupo cargado. Los colorantes bsicos- azul de metileno, fucsina bsica, cristal violeta, safranina, verde malaquita- son cationicos o tiene grupos cargados positivamente y se comercializan generalmente como sales de cloruro.

Los colorantes bsicos se unen a molculas cargadas negativamente, como cidos nucleicos y muchas protenas. Como las superficies de las clulas bacterianas estn cargadas negativamente, estos colorantes se emplean a menudo en bacteriologa. Los colorantes cidos- eosina, rosa de bengala y fucsina acida- son aninicos o poseen grupos cargados negativamente. Los colorantes cidos, debido a su carga negativa, se unen a estructuras celulares cargadas positivamente.

El pH puede modificar eficazmente la tincin, pues la naturaleza y el grado de la carga de los componente celulares cambian con el mismo. Los colorantes aninicos tien mejor en condiciones acidas, en que las protenas y muchas otras molculas poseen una carga positiva; los colorantes bsicos son mas eficaces a valores de pH mas elevados.

Para realizar los exmenes microscpicos (biopsia) es necesario someter el material en estudio a procedimientos especiales cuyo conjunto constituye la denominada: Tcnica Histolgica

Inmediato (in vivo)

Mtodos de examen

Mediato (post mortem)

Fijacin

Inclusin

Microtoma

Tincin

Montaje

Fijacin
Son generalmente sustancias qumicas que coagulan o precipitan los prtidos celulares, endurecen los tejidos y facilitan el tratamiento posterior al que sern sometidos. Ejemplos: Formalina, Bouin, ALFAC, etc.
Toma de muestra 24 horas

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Fijacin

Histoprocesamiento
Consiste en un proceso de deshidratacin progresiva con el fin de preparar la muestra (tejido) para la inclusin final.
OH100 OH96 OH96 OH100 Xilol1

OH70

Xilol2

OH70

parafina1

OH 50 parafina2

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Inclusin Final
Una vez finalizado el histoprocesamiento se procede a la formacin del bloque de parafina u otro medio de inclusin en diferentes tipos de moldes: - Barras de Leuckart Cassette - Molde de papel.
Parafina Histolgica

Tejido
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Microtoma
Los micrtomos son aparatos que permiten efectuar en forma mecnica cortes histolgicos muy finos para que los rayos luminosos puedan atravesarlos y ser observados al microscopio, de modo que los constituyentes estn en un solo plano.
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Tincin
Es el proceso mediante el cual un cuerpo toma color por la accin de una sustancia colorante y no se destie con un lavado efectuado con el solvente empleado para preparar la solucin colorante.

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Montaje
El objetivo de este paso es cubrir el corte histolgico con un cubreobjeto y dejarlo ptimo para su visualizacin microscpica.
Muestra

Porta objeto

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Microscopa
El Microscopio es un instrumento de ptica que permite ver de cerca, y aumentados, objetos pequeos o detalles estructurales imperceptibles a simple vista.

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Microscopa

ptica(2)

Procesado de la muestra biolgica para su adecuada observacin

Procesamiento de la muestra:
Permitir que la luz la atraviese y podamos observarla

Mantener condiciones cercanas a las naturales

Pasos a seguir
1. Obtencin de la muestra 2. Fijacin 3. Inclusin 4. Corte 5. Tincin 6. Montaje

OBTENCIN RECOGIDA DE LA MUESTRA

Lo ms rpida posible para evitar procesos de descomposicin

Evitar:
Autolisis por liberacin de enzimas lisosomales (ms rpida)
Putrefaccin provocada por enzimas bacterianos (ms tarda)

FIJACIN
Evitan la aparicin de alteraciones tras la muerte (autolisis y putrefaccin)

Agentes fijadores
Capacidad fijadora (evitan autolisis) Capacidad conservante (evitan putrefaccin)

TIPOS DE FIJADORES Fsicos Congelacin: N2 lquido (-121C) Isopentano (-50C) Criodesecacin o liofilizacin (desecacin por sublimacin) Criosustitucin (alcohol etlico, acetona o polietilenglicol)

Qumicos: desnaturalizacin o precipitacin de protenas

Bloqueo de la autolisis. Efecto microbicida. Evitar los efectos osmticos. Evitar los cambios de textura y composicin tisular. Efecto mordiente.

TIPOS DE FIJADORES QUMICOS Fijadores por deshidratacin tisular (disuelven las grasas): alcohol etlico, metanol, acetona Fijadores por cambio en el estado coloidal de las protenas (disminucin de PH por debajo del PI): cido actico, cido tricloroactico y cido crmico Fijadores que actan formando sales en los tejidos Fijadores que actan por reticularizacin de las protenas Mezclas fijadoras

INCLUSIN Sustancias que producen un endurecimiento de la muestra para su corte adecuado

PARAFINA

Deshidratacin previa mediante fijacin en alcohol en gradacin ascendente y su Aclarado posterior

CORTE

CORTE

TINCIN
Segn grupos cromforos: Colorantes bsicos: colorean estructuras cidas Colorantes cidos: colorean estructuras bsicas Colorantes neutros: colorean estructuras diversas Colorantes indiferentes: colorean por impregnacin fsica Colorantes metacromticos: tien de color diferente al del colorante Segn criterios de especificidad

General Especfica: colorean estructuras concretas

TINCIN

TINCIN GENERAL Y TINCIN ESPECFICA

Tincin Hematoxilina-Eosina

TINCIN GENERAL Y TINCIN ESPECFICA

Tincin de Plata. Tejido nervioso

TINCIN GENERAL Y TINCIN ESPECFICA

Tincin de Mallory. Colgeno

ALMACENAMIENTO

Preparacin y Tincin de las muestras

Aunque los microorganismos vivos se pueden examinar directamente con un microorganismos ptico, a menudo hay que fijarnos y teirlos para aumentar la resolucin, acentuar las caractersticas morfolgicas y conservarlos para su estudio en el futuro.

TINCION SIMPLE
Los microorganismos se pueden teir satisfactoriamente mediante Tincin Simple, esto es, utilizando solo un colorante. El valor de esta clase de tincin radica en su simplicidad y facilidad de empleo. El frotis, previamente fijado, se cubre con un colorante durante el tiempo adecuado, se lava el exceso de colorante con agua y se seca el portaobjetos. Los colorante es bsicos como cristal violeta, azul de metileno y carbolfucsina se emplea con frecuencia para determinar el tamao, la forma y la organizacin de las bacterias.

TINCION DIFERENCIAL
En el primer paso de esta tincin, se tie con el colorante bsico cristal violeta (violeta de genciana), el colorante primario. A continuacin, se trata con una solucin yodada que acta como mordiente. Esto es, el yodo aumenta la interaccin entre la clula y el colorante, de forma que aquella se tie ms intensamente. Luego se decolora el frotis lavndolo con etanol o acetona. Este paso produce el aspecto diferencial de la tincin de Gram; las bacterias Gram positivas retienen el cristal violeta, mientras que las Gram negativas lo pierden y aparecen incoloras. Finalmente, el frotis se tie de nuevo con un colorante bsico de diferente color al cristal violeta. La safranina es el colorante de contraste ms comn y tien las bacterias Gram negativas de rosa o rojo, dejando a las Gram positivas de color violeta.

La tincin de acido- alcohol resistencia es otro mtodo importante de tincin diferencial. Unas pocas especies, particularmente Mycobacterium no se unen fcilmente a colorantes simples y hay que teirlas con un tratamiento ms fuerte: calentando una mezcla de fucsina bsica y fenol. Una vez que la fucsina bsica ha penetrado en la cella con la ayuda del calor y el fenol, las clulas acido-alcohol resistentes no se decoloran fcilmente con una solucin acidoalcohlica, permaneciendo de color rojo. Esto se debe al elevado contenido en lpidos de las paredes de estas clulas; en partculas, los cidos miclicos, los responsables de la propiedad de cido- alcohol resistencia.

Las bacterias no cido-alcohol resistentes se decoloran con la solucin acidoalcoholico, por lo que se tien de azul con azul de metileno (tincin de contraste). Este mtodo se emplea para identificar Mycobacterium tuberculosis y M.Leprae., agente patogenos responsables de la tuberculosis y la lepra.

TINCION DE ESTRUCTURAS ESPECIFICAS

Uno de los mas sencillos es la tincin negativa, tcnica que revela la presencia de cpsulas difusa alrededor de muchas bacterias. Se mezcla las bacterias con tinta china o colorante de nigrosina y se extienden en una capa fina sobre el portaobjetos. Despus de secarlo al aire, las bacterias aparecen como cuerpos ms claros en medio de un fondo azul oscuro, porque la tinta y las partculas de colorantes no pueden penetrar ni la clula bacteriana ni su cpsula.

La extensin de la regin de luz est determinada por el tamao de la cpsula y por la propia clula. Apenas se produce modificacin de la forma bacteriana y la clula se puede teir posteriormente para conseguir una mejor visibilidad.

Las bacterias de los gneros Bacillus y Clostridium forman una estructura de supervivencia en condiciones ambientales desfavorables, excepcionalmente resistentes durante periodos largos de tiempo. Esta estructura se denomina endospora pues se desarrolla dentro de la clula. La morfologa y la localizacin de las esdosporas varan con la especie y son a menudo de un gran valor para la identificacin bacteriana; pueden ser esfricas a elpticas, con un dimetro menor o superior al de la bacteria madre. Se puede observar con el microscopio de contraste de fases o mediante tincin negativa. Las endosporas no se tien bien o mediante tincin negativa. Las endoporas no se tien bien con la mayora de los colorantes, pero una vez teidos, resisten intensamente la decoloracin. Esta propiedad es la base de la mayora de los mtodos de Tincin de endosporas..

Con el metodo de Schaeffer-Fulton, las endosporas se tien primero calentando las bacterias con verde malaquita, la preparacin con agua para eliminar el resto de colorante y se contratie con safranina. Esta tcnica revela endosporas de color rosa a rojo TINCION DE FLAGELOS Los flagelos son estructuras de locomocin en forma de hilo, tan delgados que slo se pueden observar directamente con el microscopio electrnico. Para observarlos con el M. optico, se aumenta su grosor cubrindolos con mordientes, como cido tnico y alumbre de potasio, y tindolos con pararosanilina o fucsina bsica. Los mtodos de tincin de flagelos ofrecen una informacin taxonmica importante acerca de su presencia y el modelo de su distribucin.