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Determinacin de protenas
A. Ley de Lamber y Beer B. Curva patrn C. Mtodo UV: Abs 280nm D. Mtodos colorimtricos: Biuret,para modificar el estilo deBCA. Lowry, bradford, subttulo Haga clic
Comparacin de mtodos
del patrn

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Cuantificacin de Protenas

Determinar la concentracin de protenas en una muestra biolgica es una tcnica de rutina bsica cuando se aborda un esquema de purificacin de una protena concreta, cuando se quiere conocer la actividad especfica de una preparacin enzimtica, para el diagnstico de enfermedades, as como para otros muchos propsitos.

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Cuantificacin de Protenas

a) b) c)

Existen diferentes mtodos para la cuantificacin de protenas. Muchos de estos mtodos se basan en: la propiedad intrnseca de las protenas para absorber luz en el UV, para la formacin de derivados qumicos, o la capacidad que tienen las protenas de unir ciertos colorantes.

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Ley de Lambert - Beer

Relaciona la absorcin de luz con las propiedades del material atravesado.

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LEY DE LAMBERT Y BEER

La

ley explica que hay una relacin exponencial entre la transmisin de luz a travs de una sustancia y la concentracin de la sustancia, as como tambin entre la transmisin y la longitud del cuerpo que la luz atraviesa. Si conocemos l y A, la concentracin de la sustancia puede ser deducida a partir de la cantidad de luz transmitida.

A = cl

Donde: A

= absorbencia = Coeficiente de extincin molar. l = longitud de la celda.

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COEFICIENTE DE EXTINCIN MOLAR

Es

una medida de la cantidad de luz absorbida por unidad de concentracin. compuesto con un alto valor de coeficiente de extincin molar es muy eficiente en la absorcin de luz de la longitud de onda adecuada y, por lo tanto, puede detectarse por medidas de absorcin cuando se encuentra en disolucin a concentraciones muy BAJAS.

Un

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Mtodos para determinar protenas

Intervalo

del UV Todas la protenas pueden ser detectadas, sin embargo solo ciertos residuos de aminocidos son los que se leen en la regin del UV.
Por

reacciones colorimtricas: Enlaces peptdicos o ciertos aminocidos reaccionan y los productos coloridos son los que se cuantifican

PROTENAS y la absorcin en la regin UV

Las

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bandas de absorcin ms significativas se encuentra en el ultravioleta cercano, en el intervalo de longitud de onda entre 230 y 300 nm. Concretamente absorben en este rango las cadenas laterales de los aminocidos aromticos, la histidina y la cistina. La cistina presenta una banda centrada a 250 nm, n-->s* ( max ~ 300 M-1.cm-1), pero apenas se puede considerar, ya que es muy dbil y el porcentaje relativo de puentes disulfuro es muy pequeo en una protena.

PROTENAS

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Los aromticos absorben de 260-290 nm. La

fenilalanina. Es el menos importante cuantitativamente, aunque muestra un espectro complejo con mltiples bandas diferenciadas en torno a 250-260 nm. Presenta tambin bandas de mayor energa que solapan con el espectro del enlace peptdico en 215 y 180 nm. Sin embargo como no absorbe por encima de 280 nm su contribucin al espectro en la zona del ultravioleta cercano de protenas suele ser pequea.

La tirosina presenta un mximo a 275 nm con un hombro a 285 nm. La banda se desplaza a mayores

longitudes de onda cuando se produce la desprotonacin del OH del anillo aromtico.

El triptfano agrupa al menos tres bandas diferentes.bajo el espectro centrado a 280 nm. Tambin presenta bandas
en la zona del UV lejano.

calcular la concentracin de protenas: mtodo UV

Se

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usar la ecuacin de Lambert y Beer. El coeficiente de extincin molar de la Albumina de Suero Bovino (BSA) que es 43 824 M-1 cm-1 o bien usando el coeficiente dado en porcentaje que es de 6.6 para una solucin de BSA al 1% (10 mg/mL) La frmula para determinar la concentracin de la muestra.

Desarrollo experimental Determinacin de protenas por el mtodo Abs 280 nm.

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Descongelar slo las alcuotas de las fracciones de protena destinadas para este protocolo y que fueron recolectadas durante la purificacin de la lactato deshidrogenasa. Mantener las fracciones en un recipiente con hielo durante todo el experimento. Colocar las fracciones en cuvetas de metacrilato grado UV. Leer la absorbancia las fracciones que te indique t profesor a la longitud de 280 nm.

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Calcular la concentracin de protenas con la frmula y llenar la tabla

Tubo F0 F1 F2 F3 F4 FPA FPB Absorbancia Concentracin (g/L)

NO SE NECESITA HACER CURVA PATRN

Pero para los mtodos colorimtricos se necesita una: Curva Patrn

Es

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un marco de referencia que se construye de cantidades conocidas de una sustancia (por ejemplo la albmina srica bovina) que se utiliza para determinar la cantidad de protenas presente en una muestra incgnita. En determinaciones colorimtricas, se cumple una relacin proporcional entre la magnitud o intensidad de color que da una reaccin y la cantidad del reactivo que la provoca. La intensidad de color se mide con un espectrofotmetro o colormetro en funcin de las concentraciones crecientes de la sustancia se obtiene una recta. Es decir, a mayor cantidad de protena, mayor cantidad de producto de reaccin y por lo tanto, mayor intensidad de color.

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BLANCO

La absorbancia de una solucin es la resultante de la absorbancia del soluto cuya concentracin se desea conocer y la de otros componentes del sistema (solventes, reactivos) que absorben tambin a esa longitud de onda. Se debe descartar la absorbancia de las interferencias, para ello es necesario hacer siempre una muestra que contenga todas los componentes del sistema menos aquel que se desea medir. Esta muestra se llama blanco y la absorbancia de ste debe restarse a las muestras problema y a los patrones, o bien, con el blanco se calibra el instrumento a absorbancia igual a 0, o sea 100% de transmitancia.

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CURVA PATRN

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BIURET
Se

basa en la formacin de un complejo coloreado entre el Cu2+ y los grupos NH de los enlaces peptdicos en medio bsico. 1Cu2+ se acompleja con 4 NH. La intensidad de coloracin es directamente proporcional a la cantidad de protenas (enlaces peptdicos) y la reaccin es bastante especfica, de manera que pocas sustancias interfieren. La sensibilidad del mtodo es muy baja y slo se recomienda para la cuantificacin de protenas en preparados muy concentrados (por ejemplo en suero).

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Reaccin de Biuret
La

reaccin debe su nombre al biuret, una molcula formada a partir de dos de urea (H2N-CO-NH-CO-NH2), que es la ms sencilla que da positiva esta reaccin, comn a todos los compuestos que tengan dos o ms enlaces peptdicos consecutivos en sus molculas.

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Biuret
La

presencia de protenas en una mezcla se puede determinar mediante la reaccin del Biuret. El reactivo de Biuret contiene CuSO4 en solucin acuosa alcalina (gracias a la presencia de NaOH o KOH). La reaccin se basa en la formacin de un compuesto de color violeta, debido a la formacin de un complejo de coordinacin entre los iones Cu2+ y los pares de electrones no compartidos del nitrgeno que forma parte de los enlaces peptdicos.

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LOWRY
ESTE

PROCEDIMIENTO INVOLUCRA LA FORMACIN DE UN COMPEJO COBRE PROTENA EN SOLUCIN ALCALINA. ESTE COMPLEJO REDUCE AL REACTIVO FOSFOMOLIBDICO- FOSFOTUNGSTATO LO QUE PRODUCE UNA INTENSA COLORACIN AZUL.

Este mtodo consta de dos etapas:

Primera

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reaccin Biuret. Los iones Cu2+, en medio alcalino, se unen a las protenas formando complejos con los tomos de nitrgeno de los enlaces peptdicos. Estos complejos Cu2+-protena tienen un color azul claro. Adems, provocan el desdoblamiento de la estructura tridimensional de la protena, exponindose los residuos de tirosina que van a participar en la segunda etapa de la reaccin. El Cu2+ se mantiene en solucin alcalina en forma de su complejo con tartrato. Segunda reaccin reactivo de FolinCiocalteau. La reduccin, tambin en medio bsico, del reactivo de Folin-Ciocalteau por los

BIBLIOGRAFA

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O.H. Lowry, N.J. Rosebrough, A.L. Farr y R.J. Randall. J. Biol. Chem. 193: 265-275 (1951)

Este mtodo se basa en la reaccin de Biuret, donde los enlaces peptdicos reaccionan con el Cu2+ en condiciones alcalinas produciendo Cu+, despus se reduce el reactivo de Folin por las protenas tratadas con cobre a azul heteropolimolibdeno. El color se desarrolla en la segunda reaccin (con el fosfomolibdotungstato) y es primeramente debida a los aminocidos tirosina, triptfano, y en menor grado por cistena, cistina e

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BRADFORD

v Se basa en la unin de un colorante, Comassie v v v v

Blue G-250 (tambin Serva Blue) a las protenas. El colorante, en solucin cida, existe en dos formas una azul y otra naranja. Las protenas se unen a la forma azul para formar un complejo protena-colorante con un coeficiente de extincin mayor que el colorante libre. Este mtodo es sensible (1-15 g), simple, rpido, barato y pocas sustancias interfieren en su determinacin. Entre las sustancias que interfieren estn los detergentes y las soluciones bsicas.

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Bradford
El

ensayo de Bradford es un ensayo colorimtico para la medicin de protena total en una solucin dada. Involucra la unin de un colorante el Coomassie Brilliant Blue a las protenas en un medio cido y su conmitante cambio de absorbancia de 465 a 595 nm. Debido a que el reactivo causa la precipitacin de la protena con el tiempo, la linearidad de la reaccin se encuentra comprometida. Las mediciones hay que concluirlas rpidamente.

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Diferentes
El

azul de Coomassie se une aproximadamente estequiomtrica, entonces el mtodo de deteccin tanto en solucin como en PAGE-SDS, gel u otras matrices es el mtodo preferido, cuando las concentraciones de protenas se deben determinar por densitometra.

Cambio de absorbancia del coomasie blue

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Los aminocidos que son reconocidos por el colorante son arginina, fenilalanina, triptofano y prolina. El azul de Coomasie libre se detecta a 470 nm mientras que la forma unida a protenas a 595 nm. Lo anterior debido a que el Coomassie se une preferencialmente a los aa mencionados y cambio de un

El azul de coomasie y los aminocidos que reconoce

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BCA

v El cido bicinconnico, sal sdica, es un compuesto capaz v

de formar un complejo prpura intenso con iones Cu1+ en medio alcalino. Este reactivo forma la base de un mtodo analtico capaz de monitorizar el in cuproso producido en una reaccin entre las protenas con Cu2+ en medio alcalino (reaccin de Biuret). La estabilidad del reactivo y el cromforo proporciona un mtodo para la cuantificacin de protenas que es sencillo, rpido, muy sensible, y que muestra una gran tolerancia a compuestos que afectan a otros mtodos. OHProtena + Cu2+ Cu1+

Cu1+ + BCA

complejo prpura BCA- Cu1+

Cuadro comparativo de sensibilidad de las tcnicas de cuantificacin de Protenas

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