WESTERN BLOT

WESTERN BLOT
Mtodo de biologa molecular para detectar una protena de inters usando un anticuerpo especfico. El fundamento es una discriminacin de los antgenos frente a los que se dirigen los anticuerpos presentes en la muestra .

WESTERN BLOT
Requiere:
Anticuerpo monoclonal o policlonal. Solucin que contenga la protena.

Pasos esenciales:
Transferencia de protenas de un gel a la matriz Marcado del eptope con un anticuerpo especfico.

WESTERN BLOT
Se basa en la separacin de las protenas (antgenos) obtenidas del VIH-1 procedentes del lisado del cultivo del virus . La protena viral as obtenida se coloca en un gel de poliacrilamida en forma de lminas delgadas y luego se efecta una electroforesis .

WESTERN BLOT
Despus se transfieren a una tira de nitrocelulosa. Estas tiras se exponen al suero humano diluido, despus de una incubacin se lavan y se vuelven a incubar con una IgG antihumana marcada con una enzima que con la exposicin a un revelador enzimtico producir una banda coloreada en las zonas correspondientes a los anticuerpos especficos que contenga la muestra.

Las tiras pueden contener un nmero variable de bandas :

Principales bandas del Western blot Protena Presursora de la envoltura Glucoproteina externa Glucoproteina transmembrana Precursora Proteina principal Proteina de la matriz Transcriptasa inversa Endonucleasa pol gag gen env

Denominacin gp160 gp120 gp41 p55 p40 p24 p17 p66 p51 p31

Criterios mnimos de positividad

Criterios mnimos de FDA
FDA: Existencia por lo menos de tres bandas: p24, p31 y gp41 u otra glucoprotena ARC: Existencia de al menos 3 bandas una por cada uno de los 3 genes estructurales CDC: Al menos dos bandas: p24, gp41 y gp160/120 CRSS: Al menos una banda del core (gag/pol) y otra de envoltura (env)

Preparacin de la muestra
Las

muestras pueden ser tomadas de un tejido entero o de un cultivo celular. pequea cantidad del tejido se introduce en un buffer de extraccin. Despus se procede a homogeneizarlos, sea con una licuadora (para grandes volmenes de muestra), con un homogenizador (para muestras pequeas) o por sonicacin. ltimo se centrifuga para obtener las protenas en el sobrenadante, la fraccin no precipitada. clulas pueden lisarse por uno de esos mtodos mecnicos.

Una

Por

Las

Tambin

pueden usarse detergentes, sales o tampones que favorezcan la lisis y solubilicen las protenas. veces se aaden inhibidores de proteasas y fosfatasas que evitan la digestin por las enzimas celulares de las protenas y de las fosfoprotenas, respectivamente.

Azul de Bromofenol

Fuente de tejidos

Buffer de extraccin

Tubos de microcentrifugacin

Calentador Licuadora o

homogenizador

MUESTRA

Electroforesis en gel

Las protenas de la muestra sern separadas mediante una electroforesis en gel en funcin de uno o varios de estos criterios: punto isoelctrico, peso molecular y carga elctrica. La naturaleza de la separacin depende del tratamiento de la muestra y de la naturaleza del gel. La electroforesis en gel ms frecuente, conocida como SDS-PAGE, hace uso de gel de poliacrilamida y de tampn con dodecilsulfato (SDS). En esta tcnica las protenas sufren un tratamiento por agentes reductores que provocan la prdida de las estructuras secundaria y terciaria y mantiene los polipptidos en este estado desnaturalizado. De este modo, la estructura tridimensional de las protenas no influye en la electroforesis, y pueden separarse nicamente en funcin del tamao.

Gel Buffer del Buffer del nodo cnodo Cmara de electrodo negativo Polo (+) Jeringa

Muestra

Polo (-)

Tanque

Fuente de energa

Bandas de protenas separadas

Transferencia

Para que las protenas sean accesibles a la deteccin por anticuerpos, se las transfiere desde el gel de poliacrilamida a una membrana de nitrocelulosa o de PVDF. Esta transferencia puede realizarse por difusin, por vaco o por accin de un campo elctrico (electrotransferencia). Las membranas que se emplean en el Western blot se caracterizan por su capacidad de unir protenas de forma inespecfica (es decir, se adhieren a todas las protenas con idntica afinidad) las membranas de nitrocelulosa, aunque no se conoce exactamente la naturaleza de las interacciones membrana protena, se sabe con cierta seguridad que se trata de interacciones no covalentes de naturaleza hidrfba. en las membranas de PVDF, la unin est basada en interacciones hidrofbicas y de dipolos entre la membrana y las protenas. Como particularidad, deben ser humedecidas con metanol o etanol antes de exponerlas a tampones acuosos, debido a su alta hidrofobicidad y a la ausencia de surfactantes.

 En

la transferencia por difusin simple se ponen en contacto las superficies del gel electrofortico y de la membrana y, sobre sta, se dispone un taco de papeles de filtro. Este protocolo no est muy extendido actualmente, puesto que la cantidad de protena transferida a la membrana es muy baja, mucho menor que con la electrotransferencia. Sin embargo, ha ganado cierta popularidad por una modificacin que permite obtener mltiples transferencias de un mismo gel, permitiendo de esta forma realizar varias pruebas sobre geles virtualmente idnticos. Esta modificacin es viable cuando no es necesaria una transferencia cuantitativa de

Difusin simple

Transferencia al vacio
En

esta tcnica, se aade el poder de succin de una bomba conectada a un sistema de secado de planchas de gel, el cual lleva las protenas desde el gel hasta la superficie de la membrana de nitrocelulosa. mtodo es vlido tanto para protenas de alto como de bajo peso molecular

Este

Electrotransferencia
Este

mtodo se basa en una corriente elctrica y un tampn de transferencia para llevar las protenas desde el gel hacia la membrana. Para ello, se apilan en el orden descrito los siguientes elementos (del polo negativo o ctodo al positivo o nodo): esponja, varios papeles de filtro empapados en buffer de transferencia, gel, membrana, ms papeles de filtro empapados y otra esponja. Este montaje, llamado coloquialmente sandwich, se dispone en el sistema de transferencia y se aplica una corriente elctrica, de magnitud acorde a los materiales empleados, al tiempo disponible, Las protenas del gel se desplazan hacia el polo

buffer de transferencia Polo (-)

Papel filtro Papel filtro Gel Membrana Papel filtro Polo (+)
Membrana con protenas transferidas

 Puesto

que la membrana escogida necesita poder unirse protenas de forma inespecfica, es preciso bloquear los lugares de unin que han quedado libres tras la transferencia. En caso contrario, el anticuerpo (de naturaleza proteica) empleado en la deteccin puede unirse a ellos, dificultando la distincin del complejo antgeno-antgeno que se forma con la protena que se busca. En el bloqueo se incuba la membrana con una solucin de protenas, tpicamente de albmina de suero bovino o ASB (ms conocida por sus siglas en ingls, BSA), leche en polvo o casena, con una diminuta fraccin de detergente, como Tween 20 o Tritn X-100. Las protenas en solucin se unirn a todos aquellos lugares de unin de la membrana que no estn ya ocupados por las transferidas desde el gel. De este modo, el anticuerpo slo podr unirse a su

Bloqueo

Deteccin
En

la deteccin se comprueba la presencia en la membrana de una determinada protena. Para ello se emplea un anticuerpo especfico contra ella unido a enzima que, en presencia de su sustrato, catalice una reaccin colorimtrica (produce color). De esta forma, se hace patente la unin con el antgeno, la protena, as como su localizacin. El proceso tradicionalmente se ha realizado en dos pasos, aunque ahora es posible la deteccin en un nico paso, lo cual es til en ciertos campos.

Secuencia del Western Blot

Aplicaciones
Actualmente, el Western blot es una de las tcnicas ms usadas en el estudio de la biologa molecular El Western Blot se usa como prueba confirmatoria cuando el ELISA da un resultado positivo en un grupo que no es de riesgo o en una poblacin donde la prevalencia del virus es muy baja.

Se emplea como prueba definitiva de la encefalopata espongiforme bovina, comnmente llamada "enfermedad de las vacas locas".

Algunas clases de la prueba para la enfermedad de Lyme usan el Western blot.

En veterinaria, ocasionalmente se emplea el Western blot para confirmar la presencia del FIV en gatos.

TEST DE WESTERN BLOT PARA PRUEBA DEL VIH

Objetivo- Detectar anticuerpos especficos contra el VIH1/2 Fundamento Test Inmunolineal o ELISA en banda, que detecta anticuerpos Lisado viral de clulas infectadas, sometidos a electroforsis en gel de poliacrilamida y transferido a hojas de nitrocelulosa

POSITIVO

- Si dos bandas presentan intensidad >1+ en

relacin al control , - Una banda de envoltura y la p24 - Presencia de bandas gp120, gp41, p31, p24 y p17 para HIV1 - Protenas gp105 y gp36 para HIV2

3+ 1+ +/-

Control
gp120 gp41 p31 p24 p17

gp105 gp36

 INDETERMINADO

Criterios de interpretacin

- Si dos o mas bandas presentan intensidad +/- Si una banda presente intensidad <1+ y el resto+/3+ 1+ son negativos en relacin al control
Control
Gp120 p24

NEGATIVO

Si todas las bandas presentan valoracin <+/ Ausencia de protenas

3+ 1+ +/-

Control

 Gracias