CULTIVO PURO O AXNICO

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CULTIVO PURO

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Un cultivo puro es aquel en el que todos los microorganismos provienen de una sola clula. Los cultivos puros se inician a partir de colonias aisladas, de manera que todos los individuos del mismo tengan la misma composicin gentica. Los cultivos puros son esenciales para poder estudiar las caractersticas de los microorganismos y para poder identificarlos con seguridad.

La obtencin de un cultivo puro, a partir de una poblacin mixta, se lleva a cabo en dos etapas: 1. La muestra debe diseminarse de manera tal que los diferentes microorganismos queden lo suficientemente separados sobre la superficie de un medio de cultivo slido, de manera que luego de la incubacin ellos formen colonias visibles aisladas. Este proceso se conoce como aislamiento

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USO BIOFERTILIZANTE DE DOS CULTIVOS DE CIANOBACTERIAS, UNO AXNICO Y OTRO EN CONSORCIO, A NIVEL DE INVERNADERO PARA PRODUCCIN PARCIALMENTE ORGNICA DE FRJOL Phaseolus vulgaris.

en que consiste?

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Evaluar el uso de dos cultivos de cianobacterias uno axnico y otro en consorcio, como biofertilizantes. Aplicar al sustrato y a las hojas de las plantas las cianobacterias. Se utiliz frjol debido a su rpido crecimiento, a su adaptabilidad. Se us semillas de frjol arbustivo Se realizaron dos cultivos de frjol con los mismos tratamientos, con diferente mtodo de aplicacin de Rhizobium, al sustrato y a las semillas.

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MATERIALES Y METODOS
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DISEO:

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Se estableci una cmara invernadero en macetas, utilizando un DBCA (Diseo de Bloques Completos al Azar)

Ocho tratamientos ms tres adicionales, un testigo con agua destilada (agua destilada), un testigo con agua destilada con Rhizobium y otro con fertilizante qumico,

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Los 11 tratamientos constituyeron un bloque con un total de 3 bloques, es decir, 33 observaciones por cultivo.

PROCEDIMIENTO
Preparacin de Medio:

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Se prepar medio BG110 lquido y slido, empleados en el crecimiento, mantenimiento y anlisis de los cultivos de cianobacterias utilizados a lo largo de la investigacin. componentes del medio BG11.

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Se hicieron los medios agar levadura manitol (YMA) y caldo levadura manitol (YMB) para ser usados en el crecimiento y mantenimiento de Rhizobium

Mantenimiento y establecimiento de los 4/28/12 cultivos.

Cianobacterias

El medio empleado para el crecimiento de las cianobacterias fue el medio BG110. Para obtener la biomasa y el volumen adecuados, se realiz el cultivo en frascos boeco de 1 L y de 500 mL para cada cultivo, tanto para la cepa C15 como para el consorcio, como se observa en la figura.

Se airearon los frascos por medio de mangueras conectadas a un aireador de pecera, por el otro lado de la manguera, se insert una pipeta pasteur de vidrio para la salida del aire al medio. Finalmente se cubrieron los frascos con tapones estriles de algodn para evitar la contaminacin del medio

Rhizobium

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El inculo de Rhizobium fue sembrado en tubos con agar inclinado y en cajas petri con YMA, como se puede observar en la Figura.

Se dejaron los tubos y las cajas en la incubadora a 26C durante 7 das aproximadamente. Para mantener la cepa de Rhizobium se realizaron subcultivos.

PREPARACIN Y ESTERILIZACIN4/28/12 SUSTRATO DEL

Se obtuvo la tierra negra en el INIAP

se procedi a tamizarla

Se sec la tierra tamizada en la cmara invernadero y se procedi a mezclarla.

se sacaron las fundas del autoclave, y se llenaron las macetas con el sustrato

Se autoclavaron las fundas con sustrato a 121C, empleando el ciclo por 20 minutos de esterilizacin y 30 minutos de secado; dos veces

Se introdujo el sustrato en fundas de tela

DESINFECCIN Y SIEMBRA DE LAS SEMILLAS 4/28/12 DE FRJOL.

lavado con H2O dest.

Se sumergi en alcohol 70% x 1 min.

se enjuag con agua destilada estril

cloro al 5% x 5 min.

Se cubrieron las semillas con 5 cm de tierra y c reg con 40mL de agua destilad Se colocaron las macetas en la cmara invernadero

Con una pinza estril, se tom 1 a 1 las semillas y se las coloc en la tierra de

dejando las semillas en el agua del ltimo lavado

5 lavados consecutivos con agua destilada estril

4/28/12 PREPARACIN Y APLICACIN DE LA SOLUCIN FERTILIZANTE. En la solucin fertilizante no se adicion el nitrato de calcio [Ca(NO3)2], como fuente de nitrgeno. Se adicion sustancias como:

Sulfato de potasio (K2SO4), fosfato cido de potasio (KH2PO4), sulfato de magnsio heptahidratado (MgSO4.7H2O), sulfato ferroso heptahidratado (FeSO4.7H2O), cloruro de potasio (KCl), sulfato de manganeso monohidratado (MnSO4.H2O), cido brico (H3BO3), sulfato de zinc heptahidratado (ZnSO4.7H2O), sulfato de cobre pentahidratado (CuSO45H2O) Molibdato de Sodio (Na2MoO)

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Se pes la cantidad necesaria para preparar 10L de solucin nutritiva

se afor hasta 1L y se obtuvo una solucin stock 10x,

Se reparti en 2 frascos Boeco de 500mL (stock)

Para el testigo con agua destilada (t9) no se aplic solucin nutritiva, ni se inocularon cianobacterias y Rhizobium

fertilizante qumico (t11), se adicion a la Sol. nutritiva Ca(NO3)2.

Se aplicaron 50mL de sol nutritiva a las macetas.

se tomaron 100mL de la solucin stock y se le adicionaron 900mL de agua destilada.

4/28/12 INOCULACIN DE RHIZOBIUM.

Se realizaron dos cultivos de frjol con los mismos tratamientos, pero con la diferencia fundamental del mtodo de aplicacin de Rhizobium.

El primer cultivo, se utiliz el mtodo de aplicacin al sustrato El segundo, se emple el mtodo de aplicacin a las semillas

La concentracin de Rhizobium aplicada a los tratamientos fue de 6,13x108 bacterias/mL, obtenida mediante espectrofotometra.

4/28/12 Aplicacin de Rhizobium al sustrato

Se tomo una colonia de Rhizobium

Se inoculo en (YMB) caldo levadura manitol

Se incub con agitacin por 7 das

De manera asptica, se inoculo 40 mL del caldo levadura manitol con Rhizobium en las macetas

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Se realizo la tincin de Gram y se observ

Aplicacin a las semillas

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Se tomo una colonia de Rhizobium

Se inoculo en (YMB) caldo levadura manitol

Se incub con agitacin por 7 das

Se realizo la tincin de Gram y se observ

empleando pinza estril se sembr en las macetas

Transcurrido el tiempo, se extrajeron una a una, las semillas

se tomaron las semillas estriles y se sumergi en el medio por 24hrs

Aplicacin de Cianobacterias

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De cada tratamiento se hicieron tres repeticiones. (C15 y consorcio: 20 mL y 40 mL).

Se obtuvo el nmero de cianobacterias mediante conteo en cmara de Nuebauer

Se realizo este proceso cada dos semanas, durante todo el periodo de cultivo Para los tratamientos de 20 mL, se aplicaron 10 mL en el sustrato y 10 mL fueron rociados a las hojas Para los tratamientos de 20 mL, se aplicaron 10 mL en el sustrato y 10 mL fueron rociados a las hojas

A P L I C A C I N

Anlisis de sobrevivencia de las cianobacterias en 4/28/12 el sustrato.

esptula estril

Se tom 1 g del sustrato donde fueron aplicadas las cianobacterias.

Se coloc la muestra de sustrato en una caja petri con medio BG110 slido

se incub en la cmara con luz artificial.

este ensayo dur 30 das, tiempo necesario para comprobar si las cianobacterias sobrevivieron en el sustrato mediante la observacin de crecimiento en el medio

Anlisis de sobrevivencia de las 4/28/12 cianobacterias en las hojas.

Dos semanas despus de la aplicacin foliar de las cianobacterias del cultivo axnico C15 y del consorcio.

Con una pinza estril se sujet la punta de una hoja.

se lo coloc en caja petri con medio BG110 slido

se la ubic en la cmara de incubacin durante 30 das

Medicin de altura de las plantas de frjol. 4/28/12

Dos semanas despus de la siembra, emergieron las primeras plantas de frjol, las mediciones de altura se realizaron desde la tercera semana una vez que ms del 50% de las macetas tenan plantas con la hoja unifoliada desplegada. Se realiz la medicin desde el nivel del sustrato en la maceta hasta la punta del tallo donde empieza la ltima unin de hojas

Cada tratamiento tuvo tres repeticiones, es decir tres macetas. En cada maceta crecieron tres plantas, de las que se midi la altura cada semana durante tres meses.

Medicin del rea foliar de las plantas de frjol. 4/28/12

Usando una hoja milimetrada como plantilla, se marc cada centmetro en una hoja de acetato transparente. Se coloc la hoja de acetato marcada encima de una hoja de la planta y se contaron los puntos sobre ella. Estos puntos fueron los centmetros cuadrados que midi la hoja. Se realiz la medicin de rea foliar aproximadamente a los 40 das de sembradas las semillas de frjol. El objetivo fue comparar las reas entre los diferentes tratamientos.

Peso hmedo, seco y humedad relativa. 4/28/12

se cort una planta de frjol entera en pedazos pequeos excluyendo la raz.

Pesar en la balanza analtica, este valor constituye el peso hmedo

Colocar en la estufa a 110C

Con los resultados obtenidos se calcul la humedad relativa de cada planta, mediante la siguiente frmula

Pesar en la balanza analtica, para obtener el peso seco.

RESULTADOS4/28/12
Anlisis de sobrevivencia Sobrevivencia de la cepa C15 y del consorcio de cianobacterias en el sustrato.

Se observ crecimiento de la cepa C15 alrededor del sustrato tratado con 20 mL y con 40 mL de biomasa, veinte das despus de su inoculacin en el medio BG110, tiempo normalmente requerido para el crecimiento de las cianobacterias en el laboratorio.

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CRECIMIENTO DE LA CEPA C15

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CRECIMIENTO DEL CONSORCIO EN BG11

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4/28/12 Sobrevivencia de las cianobacterias en las hojas.

Se confirm la sobrevivencia de la cepa C15 en las hojas debido a que se observ crecimiento veinte das despus de haber sido colocadas las hojas tratadas con 20 mL y con 40 mL de biomasa en BG11.

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4/28/12 CRECIMIENTO DE LA CEPA C15.

Se verific la presencia del consorcio viable ya que se observ crecimiento veinte das despus de haber sido colocadas las hojas tratadas tanto con 20 mL como con 40 mL de biomasa en BG11.

4/28/12 CRECIMIENTO DEL CONSORCIO EN BG11.

4/28/12 Crecimiento de las plantas de frjol.

Las curvas de los factores poseen aproximadamente la misma tendencia de crecimiento de las plantas de frjol durante los tres meses, en relacin a la altura de la planta. La diferencia se aprecia entre el crecimiento de las plantas tratadas con los adicionales cuyas alturas son menores en comparacin con las plantas dentro del factorial. El tratamiento con menor crecimiento fue el Haga clic para modificar el estilo testigo con agua destilada de subttulo del patrn

CRECIMIENTO DE LAS PLANTAS DE 4/28/12 FRJOL

4/28/12 SEGUNDO EXPERIMENTO

DISCUSIN DE RESULTADOS
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Se observ crecimiento aproximadamente a los 20 das de haber realizado la inoculacin en el medio BG110, lo que demuestra que las cianobacterias sobrevivieron con xito dos semanas despus de haber sido aplicadas al sustrato y a las hojas. El anlisis de sobrevivencia fue importante para la investigacin ya que de este modo se comprob que las cianobacterias se encontraban en el sustrato y en las hojas, cumpliendo activamente con sus funciones de fijacin de nitrgeno y carbono del ambiente, entre otras.
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4/28/12 CONCLUSION

El uso de biofertilizantes es un proyecto en el cual involucra los tratamientos de

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Bibliografa 4/28/12

Admin, A. (2009) Cultivo de microalgas. Extrado el 7 de septiembre, 2009, de www.renovables-energia.com/wpcontent/uploads. Biodiversity of microorganisms and insects for food and agriculture: status and needs. (2007). FAO. Commission on genetic resources for food and agriculture. Rome, pp.11-15 June 2007. Extrado el 29 de mayo, 2009 de http://ftp.fao.org/ag/cgrfa/cgrfa11/r11w153e.pdf. Brown, A. (2007) Bensons microbiological applications laboratory manual in general microbiology. New York. McGraw Hil. pp. 420. Burdass, D. (2002) Rhizobium, Root Nodules & Nitrogen Fixation. Society for General Microbiology. castro, R., Novo, R., & Castro, I. (2002). Uso del gnero Azolla como biofertilizante en el cultivo del arroz (Oryza sativa L.). Castenholz, R. (2000) Phylum BX. Cyanobacteria. Oxygenic Photosynthetic Bacteria. pp. 478-479. Christopher, A., Viswajith, V., Prabha, S., Sundhar, K. Malliga, P. (2007) Effect of coir pith based cyanobacterial basal and foliar biofertilizer on Basella rubra L. Acta agriculturae Slovenica, 89 - 1, avgust 2007. pp. 60-62. Cossoli, M., Iglesias, M., Prez, G., & Gmez, C. (2008) La biofertilizacin, su interaccin con la presencia de Rhizobium y micorrizas en el suelo. Universidad Nacional de Nordeste. Secretara General de Ciencia y Tcnica. Avda. Libertad 5400 - (3400) Corrientes. Argentina. pp. 1.

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GRACIAS!!!!