TIPOS DE VECTORES y SISTEMA HUSPED

Clonacin
La ingeniera gentica incluye el aislamiento, purificacin y replicacin de fragmentos especficos de ADN proceso denominado clonacin molecular.

Madigan y col., 2000, captulo 10

Para ello
La disponibilidad de grandes cantidades de ADN puro permite la:
Localizacin Caracterizacin Manipulacin de genes Y de sus productos

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Con el ADN clonado se puede:

Determinar la secuencia de nucletidos de un gen. A partir del cual es posible conocer, gracias al cdigo gentico, la secuencia de aminocidos de su protena producto.

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 El propio ADN puede ser utilizado como sonda para determinar la estructura de molculas de ADN ms complejas, como el genoma humano.

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Tambin
Se pueden tomar genes de organismos con los cuales es difcil o peligroso trabajar y trasladarlos a microorganismos inocuos bien caracterizados. De esta manera es posible producir sustancias biolgicas valiosas, de manera barata y en cantidades impensables.

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Por lo que
Cambiando de una manera predeterminada la secuencia de un gen clonado, los Ing. Genticos pueden literalmente disear productos biolgicos nuevos, posiblemente tiles que sencillamente no se pueden conseguir de fuentes naturales

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La ingeniera gentica
Trata de las herramientas y procedimientos implicados en la creacin y purificacin de genes deseados, mediante tcnicas que utilizan la recombinacin in vitro, o ADN recombinante.

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Pero, Qu es el ADN recombinante?

La tecnologa de DNA recombinante es un procedimiento de ingeniera gentica que se viene usando desde hace algunos aos y en la actualidad tiene una amplia variedad de aplicaciones.

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El principio de la Tecnologa de ADN recombinante

Se basa en la insercin de un fragmento de DNA forneo (Reina 2000) en un hospedero de clonaje molecular (Silva 1999) por medio de un vector de clonaje, como ser un virus o un plsmido (Moreira & Mendes 1998).
Una vez que el fragmento de DNA forneo se ha introducido en el hospedero, comienza el proceso de clonaje molecular y la recombinacin, dando como resultado la expresin del gen o los genes introducidos en un organismo diferente (Madigan et al. 1998).

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En la actualidad
Se producen alimentos transgnicos y biomolculas con esta tecnologa, la cual tambin ha abierto nuevas perspectivas en el campo de la

medicina, la gentica, la bioremediacin y la industria.

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En el campo mdico
Se aplica esta tcnica para la produccin de vacunas, para la produccin de protenas, aminocidos, vitaminas y ribonucletidos y la produccin de curas genticas para algunas enfermedades .

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En biotecnologa vegetal

La ingeniera gentica en plantas tambin ha provisto la mejora de ciertas especies hacindolas ms resistentes o introduciendo ciertas caractersticas de otros

individuos para mejorarlas (Madigan et al. 1998, Klug & Cummings 1999).

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TareaQu es la agrotransformacin?

En biotecnologa ambiental
Otra aplicacin de la tecnologa de DNA recombinante bastante reciente, es la produccin de microorganismos transgnicos para

procesos de

biorremediacin de hidrocarburos, metales pesados como el mercurio.

Las tcnicas de biorremediacin permiten una descontaminacin de ambientes afectados por medio del uso de microorganismos capaces de degradar ciertas sustancias.

Uso de cepas modificadas genticamente para amplificar su accin sobre los contaminantes.

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Finalmentela clonacin molecular o clonacin gnica

Implica crear ADN recombinante e introducirlo en una clula hospedadora en donde se replicar.

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Vectores de clonacin
Una vez que se han aislado los fragmentos de DNA de inters, por medio de enzimas, el siguiente paso es unirlos a un

vector de clonacin.
Los vectores de clonacin permiten la unin de los fragmentos de DNA extrao a su propio DNA por medio de sitios de restriccin compatibles, sin afectar su replicacin, por medio de un proceso de recombinacin.

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Actualmente
Se usan diferentes tipos de vectores para la produccin de DNA recombinante: Los principales son los plsmidos Los bacterifagos Los csmidos, vectores transbordadores, clulas eucariotas y cromosomas artificiales, entre otros.

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Plsmidos
Los plsmidos son molculas de DNA bicatenario de carcter extracromosmico y tienen la capacidad de replicarse autnomamente. Adems de transportar los genes de inters para el investigador, los plsmidos transportan otros genes que le confieren propiedades importantes al hospedador, como ser la resistencia a ciertos antibiticos.

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Tipos de plmidos
Los plsmidos pueden dividirse en dos grupos: plsmidos conjugables y plsmidos no conjugables. Los primeros promueven la conjugacin entre bacterias, pasando de una clula a otra, y confirindola nuevas caractersticas codificadas en su genoma.

Los otros actan principalmente en procesos de transformacin.

Los plsmidos se clasifican en plsmidos de fertilidad, plsmidos de resistencia, plsmidos col, plsmidos degradativos y plsmidos virulentos

Caractersticas
La utilizacin y el diseo de plsmidos para ingeniera gentica ha considerado que estos vectores contengan un nmero limitado de sitios de restriccin (puesto que la posicin es importante), y adems que posean genes de resistencia para varios antibiticos. El vector pBR322 fue uno de los primeros plsmidos usados para la construccin de DNA recombinante (Klug & Cummings 1999).

Segn Madigan et al. (1998), este plsmido presenta nueve caractersticas que lo hacen adecuado como vector de clonacin:

1. Es pequeo, slo tiene 4361 pares de bases. 2. Es estable cuando se encuentra dentro el hospedador.

3. Se pueden producir muchas copias de l, por medio de la inhibicin de la sntesis de protenas.

4. Es fcil de aislar en su forma sper enrollada. 5. Pueden clonar fragmentos insertos relativamente grandes. 6. Se conoce la secuencia completa de bases del mismo. 7. Existen sitios de restriccin nicos para las principales endonucleasas. 8. Posee varios genes de resistencia a antibiticos. 9. Es fcil de introducir a los hospedadores.

Fagos y Bacterifagos
Los virus ms empleados como vectores para DNA recombinante son los bacterifagos lambda y M13. La transduccin especializada que presentan los fagos lambda hacen que sean usados como vectores. Esta transduccin especial se basa en un proceso de eliminacin del grupo gnico central del DNA del fago, por medio de enzimas de restriccin, y la posterior insercin y ligamiento del DNA exgeno, para luego proceder al empaquetamiento del virus.

Los fagos lambda silvestres no son tiles como vectores, por lo tanto se deben producir fagos modificados, que contengan el DNA forneo. Los pasos que se deben seguir para la clonacin del fago lambda son los siguientes (segn Madigan et al. 1998): 1. Aislar el DNA del fago vector y proceder a la digestin por enzimas de restriccin. 2. Ligar los fragmentos esenciales del DNA del vector con el DNA forneo. 3. Empaquetar el DNA hbrido en extractos celulares que contengan las protenas de la cpside y la cola. 4. Producir la infeccin del hospedero.

 Los fagos M13 son filamentosos y se caracterizan por presentar una cadena de DNA simple, la cual se replica dentro el hospedero formado una doble cadena, denominada forma replicativa. Este fago es til porque resulta sencillo aadir una porcin de DNA forneo a su cadena lineal, mediante el empleo de enzimas de restriccin apropiadas.

OJO
Los vectores M13 tambin pueden ser usados para la secuenciacin de DNA, mediante la elaboracin de mapas de restriccin, que hacen ms fcil la secuenciacin del material gentico.

Csmidos
Los csmidos son modernos vectores hbridos que emplean genes especficos del fago lambda: la secuencia COS.

Estos vectores se construyen con la secuencia cos ms la porcin de DNA forneo insertada en el extremo cohesivo de este fragmento.
La porcin cos se emplea porque es necesaria para el empaquetamiento del material gentico dentro del virin lambda, las secuencias plasmdicas de replicacin y la informacin necesaria para la resistencia a antibiticos (Madigan et al. 1998, Moreira Mendes 1998, Klug Cummings 1999).

 El DNA forneo se una con la secuencia cos y penetra en la clula como un virus, pero una vez que est dentro, se comporta como un plsmido. Puesto que la mayora del genoma del fago lambda se ha eliminado, la porcin de DNA forneo que se puede introducir es mucho mayor (puede transportar hasta 50kb de DNA), lo cual constituye una ventaja frente a los otros vectores que slo pueden transportar de 5 a 10kb.

Vectores transbordadores
Otros vectores hbridos modernos, son los vectores transbordadores. Estos provienen de diferentes fuentes,como el virus SV40 y

otros plsmidos o virus vegetales y/o animales.

Los vectores transbordadores permiten introducir DNA extrao de hasta 50 kb de tamao, en contraposicin a los virus y plsmidos que estn limitados para transportar de 5 a 10 kb nicamente(Klug Cummings 1999). A menudo, los vectores transbordadores son usados para la investigacin de la expresin gnica.

Otros vectores
Adems de los vectores vistos anteriormente, existen otros que presentan algunas modificaciones tiles. Estos son los vectores de expresin y los vectores de secrecin.

Los vectores de expresin son aquellos que se emplean para obtener la sntesis de una protena codificada por el gen clonado dentro el vector.
Los vectores de secrecin hacen una tarea similar y adems exportan esta protena fuera de la clula, porque contienen unasecuencia seal (Madigan et al. 1998, Smith Wood 1998).

Hospederos para el clonaje de material gentico recombinante

Una vez introducido el DNA forneo en el vector, es necesario que ste sea incorporado a un sistema vivo para expresar los genes adicionados, la mayora de las veces. Este hospedero, normalmente es una bacteria o una clula de levadura, aunque tambin se han introducido vectores de DNA recombinante en organismos eucariotas pluricelulares (Silva, 1999).

Un hospedero debe presentar las siguientes caractersticas, para que sea considerado apto para la produccin de clones de DNA recombinante: 1.Crecimiento rpido, varias generaciones en poco tiempo. 2. Poder crecer en un medio de cultivo econmico. 3. No ser patgeno, por seguridad del investigador y el personal de laboratorio. 4. Tener el mismo origen de replicacin que el vector, para que as sea factible la insercin del DNA forneo que ste transporta. 5. Tener las enzimas adecuadas que permitan la replicacin adecuada del vector. 6. Ser un organismo del cual se tenga bastante conocimiento, como E. coli, puesto que mientras ms informacin se tenga ser ms fcil explicar los fenmenos ocurridos.

 http://www.efn.uncor.edu/dep/biologia/intrbiol/adn tema3.htm http://www.biologia.org/?pid=5000&id=65&page=2 http://home.scarlet.be/~tsk05520/biomolespa/plas midos/plasmidos-01.html

 Pagina para vacunas http://sanidadanimal.info/cursos/inmuno2/ca 091.htm

 El modelo operon El modelo de la regulacin de los genes procariotas: el modelo opern , fu propuesto en 1961 por Francois Jacob y Jacques Monod. El fenmeno que inspir la idea fu el de la induccin enzimtica. Grupos de genes que codifican para protenas relacionadas se agrupan en unidades conocidas como opern. Un opern consiste en: un operador, un promotor, un regulador y un gen estructural. El gen regulador codifica para una protena que se pega al operador, obstruyendo al promotor (y por lo tanto a la transcripcin), del gen estructural. El regulador no tiene que estar adyacente a los otros genes en el opern. Cuando se remueve la protena represora, puede producirse la transcripcin .
http://www.efn.uncor.edu/dep/biologia/intrbiol/adntema3.htm

http://www.iespalomeras.net/allnatural/imagenesweb/dibujos/plasmido.gif