Universidad Nacional

“Pedro Ruiz Gallo”

Virología
Pruebas de Infectividad y
Diagnóstico Serológico
Docente Dr. Graciela Albino
: Cornejo
Lambayeque – Marzo 2007
PRUEBAS DE INFECTIVIDAD
EN VIRUS Y DIAGNÓSTICO
SEROLÓGICO

Por : Rómulo Aycachi Inga

Lisbeth Arias Mattos
Alex Chafloque Millones
Liliana Culqui Lozada
Pruebas de
Infectividad
 Inoculación de animales
susceptibles
• Usada en estudios de • Oncogénesis viral, la
infectividad, ya que patogenia de los
algunos virus no padecimientos virales, la
provocan efectos respuesta inmune a los
reconocibles en cultivos virus y el efecto de los
celulares pero originan factores ambientales
la muerte en animales. sobre las infecciones
• Otros usos: virales, así como el
comprobación de aislamiento primario de
inocuidad y poder ciertos agentes.
protector de vacunas • Vías de inoculación:
(poliomielitis), Intravenosa,
elaboración de éstas Intracerebral,
(rabia, viruela), efecto Intraperitoneal,
neutralizante de sueros Intranasal, Intratraqueal,
inmunes y de pacientes Intradermica
• Animales más usados:
 Procedimiento general para
una prueba de infectividad:
• Realizar dilución seriada de la muestra desconocida
(diluciones decimales sucesivas ).
• Inyectar muestras de cada dilución a un cierto
número de animales sensibles.
• Tras un periodo de incubación adecuado, se
cuentan los animales vivos y muertos inyectados
con cada una de las diluciones de la serie.
• Se suele considerar como valor de referencia la
dilucion a la cual la mitad de los animales mueren.
• Desventajas: son prolijos y menos exactos que los
basados en cultivos celulares (solo resultan
esenciales en el estudio de algunos tipos de virus
como estudios epidemiológicos de enterovirus y el
diagnóstico de arbovirus.
 Inoculación de huevos
embrionados
• El cultivo de virus gripal
en huevo embrionado
fue empleado por
primera vez por Burnet
en 1935.
• Ha sido posible cultivar
virus de diversos grupos
en varias cavidades del
huevo fecundado, o en
el propio embrión en
desarrollo.
• También se emplearon
huevos de pato y de
ganso (un periodo de
• Los virus sólo pueden reproducirse en
determinadas partes del embrión; por
consiguiente, se deben inyectar en la region
apropiada, P. ej. los mixovirus crecen bien en la
membrana corioalantoidea, en tanto que el virus
de la parotiditis prefiere la cavidad alantoidea. La
infección puede producir una lesion tisular local
conocida como pústula, cuyo aspecto, a menudo,
caracteristico del virus.
• El crecimiento de un virus en un embrión de pollo
puede provocar la muerte del embrio (p.ej. virus de
la encefalitis), producir pústulas o placas sobre la
membrana corioalantoidea (como herpes, viruela,
vacuna), desarrollar hemaglutininas en los líquidos
o tejidos embrionarios (influenza) o desarrollar
virus infectante (poliovirus tipo 2).
• En el caso de los virus herpes y vaccinia, estos se
pueden cuantificar por la técnica de inoculación de
huevos embrionados al correlacionar el número de
 • A parte de las cavidades
Procedimiento: amniótica y alantoidea, se
suele usar la membrana
• Desinfectar la superficie corioalantoidea y el saco
de la cáscara con yodo. vitelino.
• Perforar con un pequeño • Algunas veces, puede
taladro estéril. inyectarse directamente el
• El agujero se sella con virus en el embrión en
desarrollo, recurriendo a la
gelatina y se incuba el inculacion intravenosa,
huevo. intraperitoneal o
• El método exacto de intracerebral.
inoculación y la edad
del embrión que se
emplea, dependen del
virus problema.
• virus de la influenza a
partir de material
recogido de la garganta,
suele inocularse en la
cavidad amniótica de
embriones de 7 a 8 días.
 Inoculacion y Aislamiento
en Cultivos Celulares
• En 1907 el biólogo
estadounidense Ross
Granville Harrison descubre
que los tejidos vivos pueden
cultivarse, es decir, pueden
crecer fuera de su órgano
original.
• En 1949 el microbiólogo
estadounidense John F.
Enders anuncia su
descubrimiento de una
técnica que permite el
cultivo de virus en cortes de
tejidos en lugar de en
órganos o en organismos
completos.
• Desde 1950, el sistema más
• Tipo de biosustrato
empleados para la
propagación de virus.
• Consisten en un sistema
formado por células
provenientes de un órgano
o un tejido, normal o
tumoral, mantenidas en
medios de cultivo de
composición química
definida y en condiciones
de temperatura, pH,
aireación y humedad
controladas.
• Los más usados son los
cultivos en monocapa
(capa de células que
• Otros sistemas (cultivos • El citomegalovirus
en suspensión, (CMV) sólo crece en
explantos, cultivos de cultivos primarios de
órganos, cultivos en pulmón fetal humano o
microcarriers. bien en algunas cepas
• No existe un cultivo celulares derivadas del
celular susceptible a mismo órgano y especie
todos los virus, de modo (MRC-5)
que un laboratorio de • Línea celular como HEp-
diagnóstico viral debe 2 no permite el
disponer de distintos crecimiento de CMV,
cultivos celulares. rotavirus, influenza,
• El virus herpes simplex pero sí adenovirus, VRS,
crece bien in vitro en parainfluenza, herpes
cultivos primarios, simples, poliovirus y
cepas y líneas celulares otros.
(MRC-5, RK, HEp-2,
Sistemas más utilizados:
• Cultivos primarios: varios tipos de células. La
mayoría crecimiento limitado in vitro,
(generalmente 5 a 10 subcultivos). Son permisivas
a un amplio rango de virus; p. e., células de riñón
embrionario humano (REH).
• Cepas de células diploides: Derivadas de tejidos
normales. En producción de vacunas, aislamiento
viral y como sustratos para probar materiales
tóxicos. Constituidas por un tipo de células que
retienen su número cromosómico diploide original
(fibroblastos de pulmón).
• Líneas celulares: Son células inmortalizadas en
el laboratorio, resisten (n) número de pases. Se
caracterizan por derivarse de tejidos normales o
de tumores malignos y se han pasado por los
• Células Vero (riñón de • BHK21 (fibroblastos de
mono verde africano) hámster)
• LLC-MK2 (riñón mono • BRL3A (epitelio de
rhesus) hígado de rata)
• BSC-1 (también de • GHI, GH3 (epitelio de
tejido normal de riñón rata)
de mono) • L929, LS, S180
• HeLa y HEp-2 (fibroblastos de ratón)
derivadas de células • L1210, L5178Y,
humanas malignas P388D1 (linfocitos de
(éstas generalmente ratón)
tienen un número
variable de
• MCF7 (epitelio
humano)
cromosomas y a veces
también son • 3T3-L1 (fibroblastos de
denominadas líneas ratón suizo)
celulares • 3T3-A31 (fibroblastos
heteroploides). de ratón BALB/c)
• Líneas celulares más usadas: células Hep-
2, HeLa y Vero
• Células diploides más utilizadas: líneas de
fibroblastos de pulmón (MRC5) para el
aislamiento de citomegalovirus (CMV).
• Cultivo primario más utilizado: riñón
humano embrionario (RHE) permisible a
los virus de circulación frecuente como el
herpes (HSV), adenovirus (ADV),
enterovirus, virus sincicial respiratorio
(RSV)
• Elección por una u otra línea celular
dependerá del virus que se quiera
evidenciar.
Fibroblasto de ratón Hepatocitos de
(3T3-L1) mono
Hepatocitos HepG2
humanos (hepatoma)
 M6 Monocapa obtenida a
(carcinoma partir de explante de
córnea bovina
de colon)
 Efecto Citopático (ECP)
• Cambios • Formación de sincicios
degenerativos • Formación de
específicos vesículas
observados en una
línea celular como
• Formación de
inclusiones
consecuencia de la
replicación de un virus • Redondeamiento y
infectante. desprendimiento de la
monocapa celular
• Puede aparecer
después de 3 ó 4 días. • Virus Respiratorio
Sincicial: formación
• A través de éstos de sincicios o células
cambios morfológicos gigantes en Hep-2
celulares es posible
poner en evidencia la • Adenovirus: células
presencia de un virus redondeadas en Hep-2
 Esquemas de algunas lesiones
citopáticas características

• Herpes simple. Inclusión eosinofílica intranuclear que desplaza

la cromatina hacia la membrana nuclear, que adquiere un
aspecto de “collar de perlas”.
• Citomegalovirus. Inclusión eosinofílica intranuclear rodeada por
un halo claro que la separa de la membrana nuclear.
• Adenovirus. Inclusión intranuclear basófila. Núcleo suele
presentar una forma de flor con una inclusión central separada
casi completamente de la membrana nuclear retraída por un
halo claro.
• Enterovirus. Inclusión eosinofílica citoplásmica que desplaza al
núcleo que se condensa. La célula aparece retraída y el
Células con efecto
Células con efecto citopático
citopatico celular celular, las células se
en forma de observan con aumento de
sincitios, por virus tamaño y forma redonda, por
virus de influenza aviar
de Newcastle
Células Vero E6 inoculadas
con muestras de orofringe Efecto citopatico del virus de
de pacientes con SRAS. la diarrea viral bovina en
Efecto citopático temprano cultivo primario de testiculo
del Coronavirus bovino
 Cuerpos de Inclusión
• Estructuras anómalas • Las intranucleares son
dentro del citoplasma o de dos tipos, A y B.
núcleo de las células
parasitadas, • Tipo A: provoca fuerte
demostrables por reacción de la materia
tinción según métodos nuclear, la inclusión se
de Mann, Sellers o aprecia con un halo
Giemsa. claro a su alrededor,
• Estas estructuras, libre de cromatina
muestran afinidad por (fiebre amarilla y el
colorantes ácidos herpes simple).
(eosina o fucsina ácida)
y son eosinófilas. • Tipo B: ocasionan poca
• Son redondas u ovales, respuesta en la célula,
de aspecto granular por lo común ocupan los
• Caracterizan a algunas espacios sin cromatina
infecciones, rabia (poliomielitis).
(cuerpos de Negrí) y • Algunos ocupan todo el
viruela (cuernos de
Cultivo celular Células epidérmicas
mostrando un con cuerpos de
corpusculo de inclusión en el nucleo
inclusión intranuclear
Corpúsculos de Negri
 Hemadsorción
• Cuando el virus infectante
incorpora proteínas virales
con propiedad de
hemaglutininas en la
membrana celular, las
células infectadas se pueden
descubrir por la adsorción
de eritrocitos de ciertas
especies animales, que se
puede observar al
microscopio de luz.
• En ortomixovirus y
paramixovirus se pueden
reconocer por hemadsorción
de eritrocitos de cobayo a
las células.
• Es posible demostrar la
infección por aquellos virus
 Técnica de
hemadsorción

+ GR cobayo =

Célula con hemaglutininas

Hemadsorción
virales