You are on page 1of 55

Boyut Eleme Kromatografisi

HURYE AKIR POLAT KILI ZEHRA ERDOAN

Boyut Eleme Kromatografisi Kolon Dolgusu Boyut-Eleme Kromatografisinin Teorisi Boyut-Eleme Kromatografisinin Uygulamalar
Jel Geirgenlik Jel Szme

Artan polarlk Suda znmez Suda znr yonik Apolar yonik olmayan polar 102 Dalma Ters Faz Adsorpsiyon Dalma 103 Normal Faz Dalma yon Deiimi

i s et Kl o M l

104 Jel Geirgenlik

105

Boyut Eleme

Jel Szme

106

BOYUT-ELEME KROMATOGRAF
Jel-geirgenlik veya jel-szme kromatografi ad verilen boyut-eleme kromatografi, zellikle yksek mol ktleli trlere uygulanabilen gl bir tekniktir.

Boyut-eleme kromatografi iin dolgu maddeleri, znen madde ve zc molekllerinin iine difzlenebilecei dzgn bir gzenek a ieren kk boyutlu ( 10- m) silis veya polimer partikllerden meydana gelmitir.

Gzenekler iinde molekller, etkin bir ekilde yakalanr ve hareketli faz akm ile uzaklatrlr. Gzenek iinde ortalama kalma sresi, analit molekln etkin byklne baldr.

Dolgu maddesinin ortalama gzenek aklndan daha byk olan molekller darda tutulur ve bylece hi alkonmazlar. Bu gibi trler ilk olarak elue edilirler. Gzeneklerden nemli derecede kk apa sahip olan molekller, labirent eklindeki gzeneklere nfuz edebilir veya geebilir. Bylece en uzun sre tutulmu olurlar. Bunlar en son elue edilirler.

Bu iki u arasnda orta boyuttaki molekllerin dolgu maddesinin gzenekleri iine ortalama nfuz etme zellikleri yaraplarna baldr. Bu grup bileikler, dorudan molekl boyutu ve bazen molekl ekli ile ilgili olarak fraksiyonlara ayrlr.
#

En iteki gzeneklere ulaabilen kk molekll bileenler, kolonda uzun sre kalrken, byk moleklller daha ksa sre kalrlar

Boyut-eleme ayrmalar dier ayrmalardan farkldr: Analit ve durgun faz arasnda kimyasal ve fiziksel etkileimler yoktur. Ayrca, dier kromatografi formlarnn aksine, hibir analit tr durgun faza tamamen nfuz ederek ok uzun sre alkonmayacandan, alkonma zamanlar iin bir st snrn olduuna dikkat ediniz.

Kolon Dolgusu
Boyut-eleme kromatografi iin iki tip kolon dolgusundan bahsedilir: 5-10 m polimer yataklar 5-10 m silis esasl partikller

Silis esasl partikller avantajlar: kolay doldurma yksek basnlarda almaya uygunluk salayan nispeten yksek rijitlik su dahil, geni bir zc aralnda kullanma izin veren daha byk kararllk yeni zclerle ok daha hzl dengeye erime ve yksek scaklklardaki kararllk
#

Silis esasl partikllerin sakncas: znen maddeleri adsorpsiyonla alkoyma meyli znen madde molekllerinin bozunmalarn katalizleme zellikleri

ok nceleri boyut-eleme kromatografi, ekilde gsterilen yapya benzer yapdaki (slfonik asit gruplarnn olmad yap) apraz balanm stiren-divinilbenzen kopolimerinde yaplyordu. Bu polimerlerin, gzenek boyutu apraz balarn oluturulmas esnasnda ortamda bulunan divinilbenzenin bal oran ile kontrol edilir.

ok sayda farkl gzenek aklna sahip polimerik dolgu maddeleri satlmaktadr. Balangta, stiren-divinilbenzen jelleri hidrofobiktir ve bu sebeple sadece susuz hareketli fazlarla kullanlabiliyordu. Ancak imdi, ekerler gibi byk, suda zlebilir molekllerin sulu zcler kullanlarak ayrlmasn mmkn klan hidrofilik jeller mevcuttur. Hidrofilik jeller: slfolanm divinilbenzenler poliakrilamidler

Ortalama gzenek bykl 40 A-2500 A olan gzenekli cam silis partiklleri u anda piyasada mevcuttur.

Adsorpsiyonu azaltmak amacyla, bu partikllerin yzeyi ou zaman organik sbstitentlerle reaksiyona sokularak modifiye edilmitir. rnein, bir hidrofilik dolgu maddesinin yzeyinin yaps yledir:

izelge 3-6, baz ticari boyut-eleme zelliklerini liste halinde vermektedir.

dolgu

maddelerinin

ZELGE 3-6.Boyut-Eleme Kromatografi iin Tipik Ticari Dolgu Maddelerinin zellikleri


Tr Tanecik Boyutu, mm Eleme Snr* Polistiren-divinilbenzen 10 Ort. Gzenek Boyutu, 102 103 104 105 106 125 300 500 1000 Mol Ktlesi

Silis

10

105

700 (0,1 20) 104 (1 20) 104 (1 20) 105 (5 > 10) 106 (0,2 5) 104 (0,03 1) 105 (0,05 5) 105 (5 20)

Boyut-Eleme Kromatografinin Teorisi


Gzenekli bir polimer veya silikajel kolon dolgu maddesinin toplam hacmi Vt :

Vt = V g + Vi + V
Vg,: jelin kat matriksi tarafndan tutulan hacmi Vi, : gzeneklerde tutulan zc hacmi Vo,: jel partikllerinin dndaki serbest hacimi

(3-9)

Herhangi bir karmann veya difzyonun olmadn kabul edersek Vo : jelin gzeneklerine girmek iin ar derecede byk olan bileenleri kolondan geirmek iin gerekli # olan zcnn teorik hacmi

Ancak, gerekte biraz karma ve difzyon meydana gelir ve alkonmam bileenlerin bir sonucu olarak, deriimin maksimum olduu noktadaki hacmi Vo olan, Gauss-ekilli bir bant gzlenir. Jelin gzenekleri iine serbeste girebilecek kadar kk bileenler iin bant maksimumu, kolonun sonunda, (Vi + Vo)a karlk gelen eluent hacminde grlr.

Genellikle, Vi, Vo ve Vg hacimleri ayn mertebeden byklklerdir. Bylece bir jel kolonu, byk molekllerden kk molekllere kadar bir numunenin minimum hacimde bir eluatla ayrlabilmelerine izin vermektedir.

Orta byklkteki molekller, gzeneklerdeki zcnn belirli kesri kadar bir zcyle tanabilir; bu ekilde alkonulan molekller iin elsyon hacmi Ve:

Ve = V + KVi

(3-10)

Eitlik 3-10, kolon iindeki btn znen maddelere uygulanabilir.

Jel gzeneklerine girmek iin ok byk olan molekller iin K = 0 ve Ve = Vo gzeneklere rahata girebilen molekller iin K = 1 ve Ve = (Vo + Vi) Eitlik 3-10un tretilmesinde, znen madde moleklleriyle jel arasnda adsorpsiyon gibi etkilemelerin olmad varsaylmtr. Adsorpsiyon ile rg boluklarnda tutulan kk molekllerin miktar artar. Bu durumda, kk molekller iin K deeri birden byktr.

Eitlik 3-10 tekrar dzenlenir:

K = (Ve V ) / Vi = c S c M

(3-11)

K : znen madde iin dalma katsays K nn deeri, tamamen dlanan byk molekler iin sfrdan, kk molekller iin bire kadar deiir. Dalma katsays, farkl dolgu maddelerinden elde edilen verilerin karlatrlabilmesi iin faydal bir sabittir.

VR, alkonma zaman ile hacimsel ak hznn arpmdr. Dikey eksenin logaritmik skalada olduuna da dikkat ediniz. Eleme snr, alkonmayan trlerin mol ktlelerini belirler. Mol ktlesi eleme snrndan daha byk olan veya bu mertebede olan btn trler, alkonmadan, birlikte elue olarak ekil ekil 3-27. (a) Bir boyut-eleme kromatografi iin kalibrasyon 3erisi. (b) Kromatogramda grlen27bdemol ktlesi eleme A piki, gsterilen kromatogramdaki A pikini snrndan daha byk olan btn bileikler, B ve C pikleri, olutururlar. seimli geirgenlik blgesindeki bileikleri ve D piki, geirgenlik
snrndan daha kk olan btn bileikleri iermektedir.

Geirgenlik snr: znen madde molekllerinin, gzenekler iine tamamen girebildii en yksek mol ktlesidir. Mol ktlesi bu deerden daha dk olan btn molekller, D ile gsterilen tek bir bant halinde elue olurlar.

Mol ktleleri eleme snrndan daha aa dtnde, znen madde moleklleri, taneciklerin gzeneklerinde ortalamann zerinde ok daha fazla zaman harcarlar ve bylece daha yava hareket ederler. Seimli geirgenlik blgesinde, kromatogramda B ve C piklerinde olduu gibi, znen maddeler fraksiyonlara ayrlr.
#

Boyut-eleme kromatografinin bir uygulamas: Dolgu maddesi, eleme snr 1000 olan, slfolama ile hidrofilik yaplm apraz bal bir polistiren polimerdir. Bu dolgu maddesini ieren 25 cmlik bir kolon, alma scakl olan 80Cde 7600 tabaka iermektedir.
ekil 3-29. Kutulanm meyva sularnda glkoz (G), frktoz (F) ve sakkaroz (S) tayini (Perkin-Elmer Corporation,
Norwalk, CT.).

Boyut-eleme unlardr:

ilemlerinin

en

byk

avantajlar

(1) ksa ve belirli ayrma zamanlar [Eitlik 3-9 ve ekil 3-27de grld gibi btn znen maddeler, kolonu Vo ve (Vo + Vi) aralnda terkeder] (2) iyi bir duyarlk salayan dar pikler (3) znen maddelerin durgun fazla etkilememeleri sebebiyle numune kayb olmamas (4) znen madde ve dolgu maddesinin etkilemesine bal kolon deaktivasyonunun olmay

Sakncalar ise unlardr: (1) Kromatogramlarn zaman skalas ksa olduundan dolay, sadece snrl sayda pik elde edilebilir (2) izomerler gibi benzer byklkteki numunelere bu yntem uygulanamaz Genellikle uygun ayrmalar iin mol ktleleri arasnda %10 farka ihtiya vardr.

Boyut-Eleme Kromatografinin Uygulamalar


Boyut-eleme yntemleri, jel szme kromatografi jel geirgenlik kromatografi

JEL SZME KROMATOGRAFS

Jel Szme Kromatografisi


- Sulu zelti kolon boyunca rnek tanmnda kullanldnda, teknik jel szme kromatografisi olarak bilinir. gre moleklleri - Jel szme, byklne ayrtrmak iin basit ve gvenilir bir yntemdir. - Dier tekniklerle kolayca paralarna ayrlamayan makromolekller dahil, biyolojik maddelerin tm snflarnn ayrlmasnda kullanm ok ynldr. #

-Kolon, jel boncuklar (desktran, agaros yada poliakrilamid polimer) ile doldurulur. Protein karm ieren tampon kolondan geirilir. Proteinlerin matriksteki porlara taklma yzdesi, bykl ile ters orantldr. Porlara taklan proteinler daha yava srklenir. -Bu yntemin byk miktarda proteinleri saflatrma gibi avantaj varken, yava ayrm yapmas da dezavantajdr. -En iyi ayrma iin kolon iine konulan rnek hacmi kolon hacminin %5 ini amamaldr. Bu yzden elde edilen rnein hacmi kk olmaldr. #

-Jel szme ayrmalarnda iki ana grup yer alr : grup ayrmalar ve franksiyonlama -Grup ayrmada, olduka farkl molekl byklndeki molekller ayrlr. Bir matris seilir yle ki byk molekller,rnek olarak proteinler, kolonun bo hacminde ele edilirler, kk molekller ise toplam hacimde tutulurlar. Grup ayrmalarna yaygn rnek tampon deiimleri ve tuzsuzlatrmadr.

Franksiyonlama, farkl byklklerde makromoleklleri ayrmada kullanlr. Bu uygulamalarda tm bileenlerin molekler byklkleri jel franksiyonlama aral iinde olmaldr. Jel szmede kullanlan franksiyonlamalarn tipik uygulamalar proteinler, peptitler ve nkleik asitlerde saflatrma ve molekl arlnn tayinidir.

Jel Szme Kromatografisinin Uygulamalar


- Enzimler ve dier proteinlerin saflatrlmas - Kresel proteinler bata olmak zere proteinlerde molekl arl hesaplanmas

Molekl Arl Hesaplanmas


-Bunu yapmak iin, molekl arl bilinen birka protein kolona gnderilmi ve bunlarn elsyon hacimleri hesaplanm. -Eer elsyon hacimleri, uygun proteinlerin log[MA] na kar grafii izilirse kullanlan jel ayrma aral iin dz bir eri elde edilir. -Eer molekl arl bilinmeyen proteinin elsyon hacmi bulunursa, kalibrasyon erisiyle karlatrlr ve molekl arl tespit edilebilir. #

ekil 3-28 Boyut-eleme kromatografinin uygulamalar. (a) Ya asitlerinin ayrlmas. Kolon: Polistiren esasl, 7,5 600 nm, eleme snr 1 103. Hareketli faz: tetrahidrofuran. Ak hz: 1,2 mL/dakika. Detektr: Krma indisi. (b) Ticari epoksi reinelerin analizi (n = polimerdeki monomerik birim says). Kolon: Gzenekli silis 6,2 250 mm. Hareketli faz: # tetrahidrofuran. Ak hz: 1,3 mL/dakika. Detektr: UV

Jel Szme Kromatografisinin Avantajlar


Molekl arl farkl molekllerin ayrlmasnda en iyi yntedir. nk ; 1)Scaklk, pH, iyonik g ve tampon kompozisyonuna baml deildir. Bylece ayrma her koulda yaplabilir.

2) ok az adsorpsiyon vardr. 3) Dier tekniklere gre blgesel yaylma daha azdr. 4) Elsyon hacmi molekl arlyla ilikilidir.

JEL GERGENLK KROMATOGRAFS

JEL GERGENLK KROMATOGRAFS


Jel-geirgenlik kromatografsi zellikle yksek mol ktleli trlere uygulanabilen gl bir tekniktir. Ama karmlardaki maddeleri molekl byklklerindeki farkllklardan faydalanarak ayrmaktr. Ayrma ilemi, rnek bileenlerinin molekl byklklerine gre olur.

www.themegallery.com

Sv Kromatografisi Kolon Uygulamalar


Polar olmayan organik zcler ve hidrofobik dolgu maddeleri kullanlr. Daha az polar olan organik zclerde znen numunelere uygulanr.

www.themegallery.com

www.themegallery.com

www.themegallery.com

Uygulama Alanlar
Byk polimer veya doal rnlerin mol ktlelerinin veya mol ktlesi dalmnn hzl bir ekilde tayin edilmesidir. rnein, eleme snr birka bin olan bir jel,proteinleri, amino asitlerden ve dk mol ktleli peptitlerden kolayca ayrabilir. rnek: Homologlarn ve oligomerlerin ayrlmasdr.

N O CO2R C R C O

TEEKKRLER

www.themegallery.com

You might also like