TECNICAS SEPARATIVAS Precipitacin.

lquido - lquido Extraccin Clasificacin: en fase slida

Destilacin

Cromatografa
1

Estado I A, B Sistema Homogneo

Proceso 1

Estado II A+ B Sistema Heterogneo

Transformaciones fsicas y/o qumicas Estado III A/ B Dos fases separadas Mecnico, fsico o raramente qumico
2

Proceso 2

CROMATOGRAFIA

Definicin: Es una tcnica capaz de separar compuestos en base a diferencias de su afinidad por una fase estacionaria y una mvil. Sistema Cromatografico: Soluto Fase Mvil Fase Estacionaria
3

Proceso Cromatogrfico (1) Proceso fsico - qumico que rige la separacin: -Adsorcin: El soluto se adsorbe en la superficie de las partculas slidas de la fase estacionaria. Es un fenmeno superficial, aumentado con la formacin de puentes de hidrgeno. - Particin o Reparto: El soluto se equilibra entre el lquido de la fase estacionaria y la fase mvil, por diferencia de solubilidad. Hasta llegar a un equilibrio
4

Proceso Cromatogrfico (2) - Intercambio Inico: Los aniones o cationes se separan en base a una columna rellena con un intercambiador de iones ( resina) - Exclusin Molecular, Filtracin o Permeacin en Gel: No existen interacciones entre la fase estacionaria y el soluto. Se separa por tamao de partcula.

Fase estacionaria

Fase mvil Lquida

Tcnica cromatogrfica Capa fina Columna Columna Papel

Proceso cromatogrfico Adsorcin I. Inico Exc. Molecular Adsorcin

Slida

Gas

Lquida Lquida Gas

Capa fina Columna Columna

Particin

Particin
6

Mtodos Cromatogrficos Fundamento: * Son mtodos en los que los componentes de una mezcla se van repartiendo de forma diferenciada entre dos fases: una mvil y otra estacionaria. * La fase mvil puede ser un gas (cromatografa de (cromatografa lquida). gases) o un lquido (cromatografalquida) * La fase estacionaria es generalmente un lquido, que recubre la superficie de partculas slidas, o en ocasiones el mismo slido. La fase estacionaria, puede ser un lecho plano (cromatografa de de capa sobre sobre (Cromatografa capa fina o fina opapel) papel) o desarrollarse sobre una columna (Cromatografa COLUMNA CROMATOGRAFIA SOBRE columnar)
7

TERMINOLOGA Y PARMETROS CROMATOGRFICOS

Eluyente : As se denomina a la fase mvil portadora de la muestra Eluato: es el trmino con el que se define la salida del eluyente ELUYENTE (entra)
columna

ELUATO (sale)

(proceso de ELUCIN Flujo: mide la velocidad de la fase mvil, se expresa como gasto en volumen ( ml disolvente/minuto de recorrido de la columna) o gasto lineal (cm de recorrido/minuto) CROMATOGRAMA: Grfica que expresa la respuesta del detector en funcin del tiempo de elucin
8

Anli i

rfi

r t r f , r it no lo r r los omponentes na muestra, sin tambien su i entifi acin cuantificacin.

Anlisis cualitati o Esta basado en la medida de parmetros cromatogrficos olmenes de retencin) ( tiempos Anlisis cuantitati o Est basado en la medida de alturas u reas de picos cromatogrficos ue se relacionan con la concentracin.

a columna cromatogrfica la forma con la ue se disea, constituye el corazn de la separacin. El detector situado al final de la columna es el ue garantiza la respuesta de los componentes que se separan ( los ay de muy di ersos tipos)
9

Anlisis cualitativo cromatogrfico Los parmetros cromatogrficos que se utilizan en el anlisis cualitativo son dos: tiempo de retencin(tR) y volumen de retencin (vR) Procedimiento: ambos parmetros han de ser comparados con los de una sustancia patrn Inconvenientes: No se tiene siempre certeza de que ambos parmetros sean reproducibles, ni an manteniendo condiciones de trabajo constantes. Es preferible utilizar valores relativos, en vez de absolutos.
Bajo condiciones de flujo de fase mvil Fc constante:

10

Tiempo de retencin

tiempo de retencin ajustado = tr = tr - tm retencin relativa = E = tr2 / tr1

11

CROMATOGRAFIA PLANA
Es muy semejante a la Cromatografa lquida tanto en aplicaciones como en funcionamiento La fase mvil se mueve por capilaridad, gravedad o bajo la accin de un campo elctrico (electro-cromatografa) a - distancia recorrida por el analito. b - distancia recorrida por el frente
12

a x

a Rf ! b

Cromatografa en Papel y Capa Fina (TLC)

Sembrado:

Puntiforme

Banda

Forma de sembrado: Manual (capilares jeringas)

13

Cualitativa x x Ausencia

x x Identificacin Cuantitativa

x x Pureza

Preparativa

x x x x
14

Fase Estacionaria (1): Particin: La fase estacionaria es lquida, sobre un soporte slido inerte. 1 - Comn (Agua) 2 - Reversa o Inversa (parafina)

El papel contiene un 20 % de agua retenido aunque nosotros lo notemos seco, esa es la fase estacionaria.

15

Fase Estacionaria (2):

Adsorcin:

Silica Gel (Oxido de Silicio). Alumina (Oxido de Aluminio). Celulosa. Fluorisil (Silicato de Magnesio). Sulfato de Calcio.

Exclusin molecular: Tierras de Diatomea Sephedex (geles)

16

Fase Estacionaria (3): Intercambio Inico: Catinicas

Acido sulfnico RSO2- H+ Acido carbxilico

Resinas

RCO2- H+ In amonio cuaternario Aninicas R3NR+ OHGrupo amina R3NH3+ OH17

Fase Mvil Polaridad Alta COOH Acidos carboxlicos Alcoholes OH Aminas NH2 Tioles SH CHO Aldehidos Cetonas CO COOR Esteres OCH3 Eteres Hidrocarburos No Saturados Hidrocarburos Saturados

Baja

18

Cromatografa de capa fina (1)

19

Revelado (1) Revelado Difiere de acuerdo al objetivo planteado Tcnica de baado Aplicacin Tcnica de pulverizacin Clasificacin de reveladores Destructivo No Destructivo H2SO4 I2 Lmpara ultravioleta
20

Revelado (2)

Generales

H2SO4 Lmpara ultravioleta

Selectivo

I2 Ftalato de anilina (azcares)

Especfico

Ninhidrina (Amino-cidos) Resorcina (Cetosas) Difenilamina + U.V. 254 (I. Clorados)

21

Cromatografa Cuantitativa Estimacin del rea de la mancha (por medida, pesada) Determinacin indirecta (raspado y valoracin) Determinacin directa (Densitmetro) Detector Fuente de luz

Placa cromatogrfica
22

Polaridad

Compuesto a Cromatografiar Compuestos inicos Acidos Fenoles Alcoholes Aminas Esteres Aldehdos Cetonas Nitro deriv. Halogeno deriv. Hidrocarburos alinfticos

Disolventes Agua Metanol Etanol Acetona Piridina Eter dietil. Cloroformo Benceno Tetracloruro de Carbono Ciloexano Eter de petrleo

Tcnica

23

Cromatografa Sobre Columna

Cromatografa Gas- Lquido Cromatografa Lquida de Alta Resolucin (HPLC)
24

Fundamento
Todo el proceso de separacin acontece en la columna A la salida de la columna existe un detector que detecta cada componente eludo La respuesta adopta la forma de un pico mas o menos Gaussiano. La separacin es tanto mas eficaz cuanto mas resueltos aparezcan los picos.
25

26

27

28

29

INSTRUMENTACIN

30

CROMATOGRAFIA DE GASES (G.C.)

31

Columnas (1) Columnas empaquetadas Son de acero inoxidable o vidrio, tienen un dimetro de 3 a 6 mm y una longitud de 1 a 5 m. Se rellenan con la fase estacionaria slida o un soporte inerte recubierto con la fase estacionaria Columnas tubulares abiertas o capilares Son de slice fundida, son mucho ms finas y mas largas que las empaquetadas. Tienen mayor resolucin y sensibilidad. Tienen menor tiempo de anlisis y se maneja menor cantidad de muestra 32

Columnas (2)

33

Gases Portadores La eleccin de la fase mvil influye en el funcionamiento de la columna y el detector. Los gases ms utilizados son: H2, He y N2. Los flujos son distintos, mientras que el de N2 es 10 cm/s, el H2 y el He pueden utilizarse a un flujo mayor.

Por lo tanto se debe mantener el el flujo del gas portador a una velocidad constante.

34

Inyeccin de la muestra (1)

La muestra se inyecta con un jeringa a travs de un septup de goma y se vaporiza. Generalmente 0.1 a 10 QL. Se controla la temperatura del horno de inyeccin. Para columnas tubulares se usan puertos de inyeccin ms elaborados pues no pueden manejarse muestras tan grande.

La inyeccin se fraciona: Slo el 0.1 a 10 % del volumen de 0.1 a 2 QL de muestra inyectada llega a la columna; el resto se elimina.
35

36

37

(CG)

Ejemplos: Conductividad trmica ( general-no destructivo) Ionizacin en llama (destructivo) Captura electrnica (especfico-no destructivo)
38

Detector de Conductividad Trmica (1)

39

Detector de Conductividad Trmica (2) Consiste en un filamento caliente de tungsteno. La resistencia elctrica del filamento aumenta con su temperatura. Cuando de la columna emerge un soluto, la conductividad trmica de la corriente de gas disminuye, de modo que el filamento se enfra, baja la resistencia y se observa un cambio en la seal de salida.

40

Detector de Conductividad Trmica (3) 1- Responde linealmente en cuarto rdenes de magnitud de concentracin del soluto. 23El H2 y He producen la mayor sensibilidad. Por ser los gases con mayor conductividad trmica. Para aumentar la sensibilidad: a- Se eleva la corriente del filamento b- Se reduce el gasto en el detector c- Se reduce la temperatura en el cuerpo del detector

41

Detector de Ionizacin de Llama (1)

42

Detector de Ionizacin de Llama (2) 1- La seal es proporcional al nmero de carbonos susceptibles de ionizarse Los tomos de carbono de compuestos orgnicos pueden producir radicales CH, los cuales a su vez producen iones CHO+ en la llama CH + O 234CHO+ + eSlo uno de cada 10 000 tomos produce un in. La respuesta es lineal en siete rdenes de magnitud de concentracin del soluto. La seal de fondo (valor de referencia) es muy estable. La sensibilidad es mas de 100 veces mayor que la del detector de conductividad trmica. Tambin es unas 2 veces mayor cuando el gas portador es N2 que cuando es He.
43

No es sensible a CO2, H2O y NH3

Otros detectores (1): Detector de captura de electrones: El N2 que entra al detector es ionizado por electrones de alta energa (rayos F) que se emiten de una lmina delgada que contiene 63Ni o 3H. Se produce una corriente hacia el nodo constante. Cuando llega una molcula de analito con alta afinidad electrnica, capturan algunos de los electrones y la corriente hacia el nodo disminuye. Es especialmente sensible a molculas que contienen halgenos, grupos carbonilo conjugados, grupos nitrilo, compuestos nitro y compuestos organometlicos. No es sensible a hidrocarburos, alcoholes y cetonas.

44

Otros detectores (2): Detector fotomtrico de llama Es un fotmetro de emisin ptica, til para el anlisis de compuestos que contienen fsforo (536 nm) y azufre (394 nm).

Espectrofotmetros de masa Espectrofotmetros de infrarrojo de transformada de Fourier

45

Mtodos Analticos (1) Anlisis Cualitativo Comparar el tiempo de retencin del pico del problema con el de un patrn. Se agrega al problema una muestra conocida. Si el tiempo de retencin es idntico al de un componente del problema, el rea de ese pico aumentar. Se debe identificar en dos o ms tipos de columnas.

46

Mtodos Analticos (2) Anlisis Cuantitativo El rea de un pico es proporcional a la cantidad de ese componente. 1- Los cromatgrafos modernos tienen integradores y computadoras que calculan las reas 2- Planmetro. 3- Para un pico gaussiano, el producto de la altura por el ancho medido a la altura media es igual al 84 % del rea total 4- Puede dibujarse un tringulo con dos lados tangentes a los puntos de inflexin en cada lado del pico. El rea es 96 % del rea de un pico gaussiano.
47

Mtodos Analticos (3) Cmo los detectores no responden de la misma manera a todos los solutos, debe medirse un factor de respuesta emprico F Concentracin del soluto rea del soluto =F Concentracin del patrn rea del patrn

48

INSTRUMENTACIN

49

CROMATOGAFIA LIQUIDA DE ALTA PERFORMANCE (H.P.L.C.) Jeringa o vlvula Gases para la muestra disueltos Introduccin Desgasificador Precode la muestra lumna de disolventes Espacio trmico Abastecimiento de disolvente Filtro Bomba Vlvula de seguridad y purga Descarga Medidor de presin Columna analtica Lectura Amplificador Recoleccin o descarga
50

Fase estacionaria Todos los tipos de cromatografa pueden realizarse en el modo de alta resolucin. Un soporte comn es el partculas microporosas de slice con dimetro de 5 a 10 Qm.

51

Disolventes

Los disolventes utilizados deben ser muy puros. Se puede utilizar un solo disolvente (eleccin isocrtica). Se puede cambiar un solo disolvente por otro luego de un tiempo apropiado. Se puede cambiar continuamente de composicin del disolvente (eleccin por gradiente).

52

Bombas

La calidad de una bomba es determinada por el grado de estabilidad y reproducibilidad del flujo que genera

Se trabaja hasta 10 mL/min a presiones hasta de 40 Mpa (400 atm)

53

Vlvula de Inyeccin:

54

HPLC

(Detector de ndice de refraccin)

55

Detector Ultravioleta (1)

Celda de flujo: 0.5 cm de camino ptico y 10 QL de capacidad

56

Detector Ultravioleta (2) Es el detector ms utilizado, porque muchos solutos absorben dicha radiacin y es bastante sensible a ella El sistema ms simple emplea la emisin a 254 nm de una lmpara de mercurio y deteccin a una sola longitud de onda. Tambin se utilizan una lmpara de deuterio y un monocromador para mediciones a longitud de onda variable. El intervalo lineal comprende cinco rdenes de magnitud de concentracin de soluto
57

Detector de ndice de Refraccin Es casi universal, responde a casi cualquier soluto. La sensibilidad es unas mil veces menor que la de un detector ultravioleta, y no es til en gradiente. Detector Electroqumico Es bastante selectivo, porque slo cientos analitos se oxidan o se reducen con facilidad. Pueden detectarse por oxidacin: fenoles, aminas aromticas, perxido y mercaptanos. Y por reduccin: cetonas, aldehidos y nitrilos.
58

Otros detectores:

Detector ultravioleta ndice de refraccin elctroqumico fluorescencia conductividad espectrofotometra de masa infrarrojo de tranformada de Fourier

Lmite de deteccin 0.1 - 1 100 - 1000 0.01 - 1 0.001 - 0.01 0.5 - 1 0.1 - 1 1000

Util con gradiente? si no no si no si si

59

CROMATOGRAFA LQUIDA vs CROMATOGRAFIA DE GASES

Son al da de hoy dos poderossimas herramientas de anlisis Ambas admiten acoplamiento con otras tcnicas de deteccin (hibridacin de tcnicas, por ejemplo con espectrometra de masas o plasmas..etc) La cromatografa de gases, requiere muestras gaseosas o fcilmente volatilizables. El resto de muestras que no poseen esas caractersticas pueden ser analizadas por HPLC.

Ambas tcnicas por su versatilidad, y por las diversas posibilidades que ofrece la seleccin de la columna cromatogrfica, permiten abordar anlisis de multicomponentes en muestras de diversa procedencia, con elevada precisin y sensibilidad (dependiendo del detector).

60

EJEMPLO CG

61