HAZIRLAYAN: Eda AIKGZ DANI MAN: Do. Dr.

Deniz YILDIZ MUSTAFA KEMAL N VERS TES (2010)

Yksek h zda gerekle tirilen ay rmalar n yap ld kromatografi sistemlerine, Yksek Bas n S v Kromatografi (HPSC) denir.

sv

Yksek bas n alt nda s v olan hareketli faz ile kat olan sabit faz aras nda maddelerin da lma esas na dayanan ay rma yntemidir.

Ay rma prensibi, kar mdaki bile enlerin sabit faz zerinde farkl zaman harcamas esas na dayan r.Sadece burada dikkat edilmesi gereken noktalar;zclerin mutlak suretle kabarc k olu umunu engellemek iin gaz gidericiden geirilmesi gerekti i ve pompan n bas n de i ikliklerini engelleyecek ekilde al t r lmas d r.

Yksek Do

bas nta kolon doldurulmas

ru, d k hacimli enjektr kullan m d k hacimli dedektrler

Duyarl

yi pompalama sistemlerinin kullan lmas

bir da l m aral nda ok kk partikllerin kullan lmas (Uniformgzenek boyutu ve da l m )

Dar

Partikl Bas

boyutu ok kk(3.5-10 m) matrikslerin kullan lmas

nca dayan kl paslanmaz elik kolonlar n kullan lmas i bas n ve kontroll ak h z sa lanmas

Yksek rnek

gereksinimin az olmas

ak dedektrleri ile kk miktarlar n tayinine olanak sa lanmas

Otomasyona H

Srekli

msait

zl analiz imkan ay rma gc

Yksek

Eluentin; enjektr, kolon ve dedektr boyunca srekli sabit ak n n kontroln gerekle tiren niteler Microbore Pompa Sistemleri Ak h z na gre Standart bore sistemleri
Preperatif pompa sistemleri

Pompan n yap ld

malzemeye gre

metalik ametalik r nga tip Piston pompa

Mobil faz iletme mekanizmas na gre

HPLC donan m n olu turan enjektr rne in sabit faz (kolon) ncesinde mobil faza enjekte edilmesi iin kullan l r. Elle kumanda edilen manuel ve bilgisayar kumandal otoenjektrler olmak zere 2 e idi bulunmaktad r.

Modern HPLC donan m n n 4 temel yap ta ndan birisi olan kolon, karma k rneklerde bile enlerin birbirinden iyi znrlkle ay r m ndan sorumlu sabit fazd r. Kullan lacak mobil faz n ve uygulanacak HPLC metodunun zelliklerine ve analizi yap lacak rne in bilinen kimyasal ve fiziksel zelliklerine gre seilmelidir. Seilecek kolonun HPLC uygulamas nda kullan lacak ak h z ve dolay s yla olu acak bas nca dayan kl olmas na dikkat edilmelidir.

Yzeyde bulunan porlar n boyutu olduka nemlidir. Uygulanacak olan rne e gre bunu iyi ayarlanmas gerekiyor.

Kolon uzunlu u

al konma (retention)

Ak H z : kolondaki partikl boyutuna ba l ve ters orant l .

Kolondan ele olan rnek bile enlerinden al nan cevap do rultusunda sinyallerin kromatogram zerinde pik olarak ifade edilmesini sa layan nitelerdir.

UV-Grnr Blge Dedektrleri  -Sabit Dalga Boyu  -De i ebilir Dalga Boyu  -DiodeArray  Floresan Dedektrler  Refraktif ndeks Dedektrler  Elektrokimyasal Dedektrler  Radyokimyasal Dedektrler  KondktmetrikDedektrler  Ktle Spektrometrik Dedektrler  Evaporatif I k Sa l m Dedektrler


A) Normal faz (Normal phase-NP) (ilk geli tirilen teknik, kolon polar, mobil faz apolard r, kullan lan kolonlar silica gel, cyano, amino, diol veya nitro kolonlard r) B) Ters faz (Reverse phase-RP) (en s k kullan lan teknik, kolon apolar, mobil faz polard r, kullan lan kolonlar C18, C8, C4, phenyl, TMS, Cyanodur) C) D) E) F) Ters faz iyon ifti (Reverse phase ion pairing-IP) yon de i im (Ion exchange-IC) Size exclusion SEC (GPC/GFC) Kiral ay r m (Chiral separation)

` ` ` `

1. Bas nc n artmas
Sorun HPLC cihaz n z n kar t bas nc srekli olarak artmakta ve ba lang de erini % 10 a maktad r. Nedenler **Giri k lcal borular t kal , kolon t kal , Detektr hcresi t kal olabilir. T kan kl klar u sebeplerden kaynaklanabilir: - Mekanik kirlenmeler, pompa contalar nda a nma, enjektr valf ndaki rotor pistonunun a nmas . - Dklen tampon tuzlar ve numuneler. - Bakteri remesi ve zelti iindeki di er kirlenmeler.

T kanman n oldu u yeri tespit etmeye al n Bunun iin, Pompa al r halde iken Pompa ile Detektr aras ndaki tm vida ba lant lar n a n. Vidalar aarken Detektr ile ba lay p Pompaya do ru ilerleyin. Burada bas nc n belirgin ekilde nerede d t ne dikkat edin. Gerekirse t kal k lcal borular de i tirin. ayet sebep szge veya filtreler ise, bunlar n yenilenmesi veya de i tirilmesi gerekir.

2. znrl n azalmas veya d k ayr m etkisi Sorun: Kromatogramda elde etti iniz znrlk giderek ktle mekte, pikler gittike geni lemektedir. Pikler asimetrik bir ekil almaktad r. ift pikler belirmektedir.

Nedenler **Kolon, gl ekilde al konan bir madde ile kirlenmi

durumda. zc maddenin veya numunenin sebep olabilece i kirlilik, numune ile kuvvetli ikincil bir etkile ime giriyor. **Kolon iindeki dolgu maddesinde kanallar olu mu . Kuvvetli bas n darbeleri veya mekanik etkiler ile etkilenen dolgu yata , buna sebep olabilir

3. Kolonun ayr m performans n n de i kenlik gstermesi Sorun:Kolonun ayr m etkinli i sabit de il. Bir enjeksiyonda iyi bir ayr m elde ederken bir di erinde geni veya st ste binmi pikler elde ediyorsunuz. Nedenler: o u defa sorun kolonun a r yklenmesinden kaynaklanmaktad r. Bir kolonun yklenebilirli i ierdi i durgun faz n ktlesine ba l d r.

- Ktlesel yklenebilirlik s n r : 100 g/g durgun faz - Hacimsel yklenebilirlik s n r : 50 l/g durgun faz

HPLCde elde edilen kromatogramda piklerin zellikleri olduka nemlidir. Pikler ile ilgili olarak;  Paral pikler (Blnm pikler)  Piklerin Ular  Piklerin geni li i gibi zellikler nemli olup sistemdeki olas problemler hakk nda da bilgi sahibi olmam za yard mc olmaktad r.
`

** Paral pikler genelde kolondaki kirlilikten kaynaklanmaktad r.

**Pik geni li inin fazla olmas

lemde kullan lacak olan mobil faz n pHs n olduka etkilidir. pH ayn zamanda rne in kolondaki al konma sresini de etkilemektedir.

** Hayalet Pikler : rnek enjekte edilmedi i halde grnen piklerdir

Nedeni: Mobil faz kirli i olmas ndan kaynaklan yor

Piklerin ak mas Bile iklerin al konma zaman daha k sa al konma srelerine kaymas ile olu uyor. Nedeni:

Numunenin znd zcnn gc >> hareketli faz gc

Di er nedeni ise;
l giri i eki l haci ir

Piklerde asimetri **Kolonda a r ykleme yap nca

`

** A r metaller, kt kolon, art k maddelerin etkisi

HPLC gnmzde kimya, biyokimya, biyoteknoloji, farmakoloji, t p kimyas , bitki kimyas , tar m ve kimya mhendisli ini ieren alanlarda ay rma ve analiz iin vazgeilmez bir ara olarak kabul edilmektedir. Bilhassa di er kromatografik tekniklere uygun olmayan bile iklerin ayr lmas ve analizi iin uygundur. evre s cakl nda termal olarak karars z bile ikleri ve yksek polarl ktaki bile ikleri herhangi bir trevlendirme olmaks z n ay rabilir ve analiz edebilir.

Preparatif HPLC Safla t rma dentifikasyon Miktar Tayini Kimyasal Ay rma

Gnmzde de i ik alanlarda yap lan biyokimyasal al malarda HPLC ok s k kullan lmaktad r. HPLC di er kromotografik tekniklerden daha gvenilir oldu u iin biyokimyasal analizlerde tercih ediliyor. Hastanelerde, Adli T p Kurumlar nda, G da sektrnde ve Sanayinin birok alt dal nda biyokimyasal analizler yap yor.

Hastanelerde daha nce klasik yntemler kullan larak yap lan baz analizler HPLC ile daha h zl yap labilmektedir. Bu analizler:
` ` ` ` ` ` ` ` `

Epinefrin, Norepinefrin, Dopamin, Metanefrin, Normetanefrin, VMA, HVA , 5 HIAA, Homosistein

Eritrositlerdeki Glutatyon miktar olduka nemlidir. Daha nce k rm z kan hcrelerinde bulunan glutatyon miktar n n analizinde glkler ya an yordu. Gnmzde HPLC ile eritrositlerde toplam ve indirgenmi glutatyon miktar kolayl kla analiz edilebilmektedir.

HPLC, hemoglobin molekllerinin ayr t r lmas ve miktarlar n n belirlenmesinde kullan lan h zl , gvenilir ve tekrarlanabilir bir yntemdir. Zay f iyon de i tirici (anyon veya katyon de i tiriciler) kolonlar Hb'lerin analizinde yayg n olarak kullan lmaktad r. Ayr ca globin zincirlerinin ayr t r lmas ve miktarlar n n belirlenmesinde ise reverse faz kolonlu HPLC kullan l yor. HPLC talasemi ve anormal hemoglobinlerin saptanmas nda do ru ve hassas bir metottur. H zl , gvenilir ve tekrarlanabilir olmas ndan dolay talasemi taramas nda tercih edilir. Prenatal ve postnatal talasemi tedavisinde ok kullan l yor

HPLC vitamin analizlerinde de kullan labiliyor. Vitaminler genelde kendileri ile benzer kimyasal zelliklere sahip bile ikler ile kombine halde bulunurlar. Vitamin tabletlerinde suda znebilme zelli ine sahip vitaminlerin belirlenmesinde kullan labilir.

zellikle suda znen vitamin ile ilgili yap lan analizlerde Smartline RFHPLC kullan l yor. Bunun iin genellikle C16 kolonlar tercih ediliyor. Ya da znen vitaminlerin (A,D,E,K) analizinde ise HPLC-ELSD (Evaporative Light Scattering Detector) . A ve E vitaminlerinin analizlerinde Flouresans dedektrl HPLC kullan l yor.

HPLC zellikle diyabet hastalar nda HbA1c de erlerinin belirlenmesinde kullan l yor. Kan ekeri artarsa hemoglobin ekerlenir ve buna HbA1c denir. HPLC ile plazmadaki eker konsantrasyonu ve HbA1c de erleri ok h zl bir ekilde belirlenebilmektedir.

HbA1c de erinin belirlenmesinde Katyon de i tirici HPLC (CE-HPLC) den yararlan lmaktad r. Burada hemoglobin trleri yklerine ba l olarak ayr maktad r. HbA1c beta zincirinin N-terminal(Valin ) amino grubuna glukoz ba lan yor. HbA1in di er trleri (-) ykl oldu u iin HbA1cye oranla daha h zl ayr l yor.

Lipitlerin ve spesifik steroidlerin analizlerinde ise RP-HPLCCorona CAD (Charged Aerosol Detector)

HPLC mobil faz Nitrogen gaz ile sprey hale getiriliyor Ortam s cakl nda solvent buharla yor ve analit partiklleri olu uyor

Yk meydana getirmek iin iyonize nitrogen gaz ile kar t r l yor yon Trap reaksiyona girmeyen iyon gazlar n uzakla t r yor Ykl olan partikller bir sinyal meydana getiriyor Olu an sinyal elektrometre ile okunuyor.

` ` ` ` `

Adli toksikoloji departman nda zehirlenmelere ba l lm olaylar n n ayd nlat lmas nda DNA ile ilgili al malarda Kan rneklerinde referans olabilecek molekllerin belirlenmesinde Vcut s v lar nda bulunan aminoasitlerin konsatrasyonlar n n llmesinde Kandaki hemoglabin varyantlar na bak larak ortamdaki lekenin insan veya di er canl lara ait olup olmad n n ortaya kar lmas nda HPLC sistemlerinden yararlan lmaktad r

Gz S v s nda ve Serebrospinal S v da lm Sebebi ve Zaman na li kin Serbest Aminoasit Konsantrasyonu belirlenmesinde HLPC kullan l yor.

` `

Serbest aminoasitler HPLC ile direkt olarak analiz edilemiyor. Reverse Faz C18 silika kolon ile ayr t r l yor

PTC kromofor da 245 nmde belirleme ( lem 25-30 dk srmektedir

1. PROTEOM K ALI MALARDA HPLC

`

Proteinlerin safla t r lmas ve protein zeltisinin tuzunun giderilmesi

Protein identifikasyonunun ilk a amas nda

` 1.

Protein ve polipeptidlerin primer yap lar n n ayd nlat lmas da EDMAN degradasyonu

2. Bu yntem otomasyona ba l olup elde edilen PTH-AAsler HPLC ile

ayr t r l p belirlenmektedir.

Monolitik , nano ve switching mode kolonlar ile daha h zl ve etkili ay r m MALD ve elektrosprey ile kombine halde bulunan dedektrlerin geli tilmesiyle ile giri im yapan pikler azalt larak daha net verilerin elde edilmesi.

Boncuklardan ok porlu kanallara sahip, HPLCnin iinde kullan lan zel tipte kolonlard r. ` Makropor yap l (2m) veya mesoporlu yap da(15nm) ` Avantaj : d k multiple-path ve retiminin kolay olmas ` Dezavantaj : dikkatle gerekle tirilmesi gereken bir organik senteze ihtiya duymas d r. ` Monolitler **Organik polimer esasl monolitik kolonlar Sol-gel teknolojisi ile haz rlanma Bazik zclerle kullan lmaz ** norganik silika esasl kolonlar Akrilamit, metakrilat ve stiren esasl polimerler iermektedir Geni pH aral nda al ma
`

` `

Nano-HPLC Multidimentional HPLC sistemleri Yksek hassasiyet Yksek ay r m kapasitesi ve pik kapasitesi Minimal rnek kayb Daha az rnek ihtiyac

` ` ` `

` ` `

PTMs ( Post Translasyonel Modifikasyonlar) belirlenmesinde HPLC sisteminden yaralanabilmek iin Hosoyo ve arkada lar de i ik kolonlar ve yntemler geli tirmi tir. Mobil faz olarak SU kullanm lar. Sistemde organik solvent kullan m n n minimalizasyonu Fosfopeptidlerin analizinde sorun metal yzeylere afinite HPLc sisteminin metal yzeyinde kompleks olu umu . Bu problemin zm Polieter eter kolon(PEEK) ya da Titanyum injektr, filtre ve kolonlar n kullan lmas .

`
`

2. METABOLOM K ALI MALARDA HPLC

Metabolik yol izlerinin (Pathway) ayd nlat lmas ile ilgili yap lan al malarda kullan l yor. Pathwaylerin belli basamaklar nda olu an maddelerin ayd nlat lmas

` ` `

` `

Metabolomik al malada HPLC tek ba na kullan lmamaktad r. Di er yntemler birlikte kullan larak al malar yap lmakta. HPLC-PDA-MS-SPE-NMR ieren kombine sistemler RP-HPLC kullan m daha yayg n al malarda HPLC kolonlar analizi yap lacak ok kk molekller ile istenmeyen kompleks molekller olu turmayacak ekilde modifiye ediliyor En yayg n kullan lan kolon: Xterra C18 RP column En yayg n kullan lan dedektr: Coulometric Array Detector

ekil: Penicillium chrysogenumun bir straininden izole edilen sorbicillin trevli alkolloidlerin yeni bir yesi olan Sorbicillacton-A n n biyosentetik orijin ve identifikasyonu ile ilgli bir al mada HPLC kullan m . Plasmodium da glutatyon metabolik yol izinin ayd nlat lmas

3. TRANGENOM K ALI MALADA HPLC DNA ve RNA miktralar n n belirlenmesinde kullan l yor Nkleik asitlerin yap s nda bulunan A,G,C,T,U gibi nkleotidler belirlenmesi Yakla k olarak 50 nt uzunlu undaki oligonkleotitlerin belirlenmesinde  Anyon-Exchange HPLC  Reversed-Phase HPLC tercih edilmektedir Nkleotidleri ieren mutasyonlar n ara tr lmas nda ise daha ok DHPLC ` DHPLC, tan mlanmam mutasyonlar n genetik tan s nda, DNA Separation Teknolojisi ile birlikte kullan lan Transgenomik WAWE DNA Fragment Analiz Sistemidir.

1.A AMA

*Amplifikasyon * Denatrasyon * Reanealing

2.A AMA *TEAA( Trietilamonyum asetat)(+) *ACN (Asetonitrat)

3.A AMA *UV detektr * Birden ok pik olu umu *Mutasyon

RNA konsantrasyonunun belirlenmesinde HPLC Armored RNA fosfodiesteraz ve alkalin kullan ralar kesiliyor HPLC ile nkleositlerin olu turdu u pikler llyor. Armored RNA sekanslar na dayan larak preparat iindeki RNA konsantrasyonu hesaplan yor.
Armored RNA Quant

In vitro Armored RNA Quantification

HPLC Assay

Determination of RNA concentration by HPLC

Birok biyokimyasal analizde HPLC kullan labilir. HPLCnin kullan m n yayg nla t rabilmek ve daha iyi sonular alabilmek iin: HPLC sisteminde modifikasyonlar n yap lmas (Kolon, Detektr, Pompa)

Yap lan de i ikliklerin optimize edilmesi

Btn yap lanlar n belli standardizasyonu