Epigenetik modifikasyonlarla

çalışma yöntemleri

www.plantcell.org/cgi/doi/10.1105/tpc.110.tt0110b
 Epigenetik modifikasyonlarla
çalışma yöntemleri
• DNA metilasyonu– bisülfit dizileme

TTCGCCGACTAA TTCGCCGAuTAA

• Histon modifikasyonu
• kromatin immunopresipitasyonu (ChIP)
• DNA adenosin metilasyon tayini (DamID)

• siRNA üretimi– derin dizileme

Bisülfit uygulaması sitosin ve metil
sitosini ayırır
NH2 NH2
CH3
Metil-
N N
sitosin
TTCGCCGACTAA
O N O N

Uygulama Bisülfit
~ ~ yok uygulaması
sitosin 5-metilsitosin

Bisülfit TTCGCCGACTAA TTCGCCGAuTAA

uygulaması
DNA’ya bisülfit
O NH2
CH3
uygulandığında,
N N
metillenmemiş sitosinler
O N O N
urasile dönüşür. Metil
sitosin etkilenmez.
~ ~
urasil 5-metilsitosin
Bisülfit uygulaması sitosin ve metil
sitosini ayırır
Metil-
sitosin TTCGCCGACTAA

Bisülfit uygulamasından Uygulama Bisülfit

sonra C ler T olarak yok uygulaması
okunur ve uygulamalı ve
uygulamasız örneklerde
farklıdırlar. TTCGCCGACTAA TTCGCCGAuTAA

Buna karşın metil-C ise TTCGCCGACTAA TTCGCCGATTAA

ayni örnekte C olarak
okunur.
Kromatin immünopresipitasyonu(ChiP)
Modifiye histon
(örn.. H3K4me)
DNA nın histona
çapraz bağlanışı
Kromatin immünopresipitasyonu
(ChiP)
DNA nın histona
çapraz bağlanışı

DNA’yı ufak parçalara

ayır ve modifiye histona
özgün antikor ekle,
affinite saflaştırması ile
antikor ve bağlı histon
kompleksini ayır.
Kromatin immünopresipitasyonu
(ChiP)
DNA nın histona
çapraz bağlanışı

DNA’yı ufak parçalara

ayır ve modifiye histona
Çapraz bağlantıyı yok özgün antikor ekle,
et, DNA’yı saflaştır ve affinite saflaştırması ile
PCR, dizileme veya antikor ve bağlı histon
mikroarray ile analiz kompleksini ayır.
yap.
 DNA adenin metilasyonu ID (DamID)

Bir füsyon Dam bir adenine

proteini Dam ve metiltransferaz ve
ilgilenilen bir Dam GATC dizi özgüllüğü
İlgilenilen
protein metilaz (E. vardır.
protein
Coli’den)
(örn. LHP1)

T C
A
G Füsyon proteini
kromatinin seçilen
bölgesine (örn.
H3K27me3) bağlanır
ve GATC bölgesi
yakınındaki metiller.
adeninleri
 Metilasyon metilasyona duyarlı
enzimlerle tanımlanabilir.
Bağlanma Bağlanma
GATC GATC
bölgesi bölgesi
yakınında DpnII restriksiyon yakınındaki
olamayan endonukleaz sindirimi yer
yer (metilasyon duyarlı)

GATC GATC
PCR amplifikasyonu

GATC GATC

ÜRÜN YOK ÜRÜN

OLUŞUR
Derin dizileme “gelecek generasyon”
DNA dizileme yöntemleri

“Klasik ” DNA “Gelecek generasyon”

dizileme – Bir DNA dizileme– one
seferde bir molekül milyonlarca molekül
dizilenir. bir seferde dizilenir.
Reprinted by permission from Macmillan Publishers, Ltd: NATURE copyright 2005. Margulies, M., et al., (2005)
Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors. Nature 437: 376-380.
 Klasik DNA dizileme
Base

+
Dört standart dNTPs

Fluorescently-labeled ddNTPs

+ Primer
Template strand
5’CCGGTTAA
3’GGCCAATTAAGCGGCTGATT

+ DNA Polimeraz
 Klasik DNA dizileme
Primer 5’CCGGTTAA
Template strand 3’GGCCAATTAAGCGGCTGATT

Primer 5’CCGGTTAAT
Template strand 3’GGCCAATTAAGCGGCTGATT

Primer 5’CCGGTTAATTC
Template strand 3’GGCCAATTAAGCGGCTGATTT

DNA polimeraz etiketlenmemiş dNTPlere veya

etiketli ddNPTlere bağlanır, sonuçta etiketli farklı
boyutta moleküller oluşur.
Klasik DNA dizileme

DNA
molekülleri
elektroforez ile
ayrılır.

Detektör

Laser
TTCGCCGACTAA
 Gelecek generasyon dizileme
yöntemleri: Pyrodizileme
Primer 5’CCGGTTAA
Template strand 3’GGCCAATTAAGCGGCTGATT Pyrodizilemede etiketli
nuklotidler ve ddNTPler
kullanılmaz.
Pyrophosphate
T
nukleotid eklenmesi ile
açığa çıkar ve
substrat...

Primer 5’CCGGTTAAT
Template strand 3’GGCCAATTAAGCGGCTGATT
 Pyrodizileme - Kimya

....veya ATP
sufurilaz, ATP
Oluşturur ....
ATP Sulfurilaz
PYROPOSFAT
Adenosin 5’
+ posfat sulfat
ATP
 Pyrodizileme - Kimya

ATP luciferaz tarafından ışık uyarımını tetikler.

ATP Sulfurilaz LUCIFERAEZ

PYROFOSFAT
Adenosin 5’
+ fosfat sulfat
ATP
+ Işık
oluşumu

Luciferin
Pyrodizileme - Kimya

T
 Pyrodizileme – data
değerlendirilmesi
BİRİNCİ DÖNGÜ
5’CCGGTTAA dTTP
3’GGCCAATTGAGC....

Reaksiyon yok

dTTP
5’CCGGTTAAT
dNTPs eklenir ve 3’GGCCAATTACGA...
eklenme ışık PPi ATP
oluşumu ile izlenir.
 Pyrosequencing – data
değerlendirilmesi
İKİNCİ DÖNGÜ
5’CCGGTTAAC dCTP
3’GGCCAATTGAGC....

PPi ATP

dCTP
5’CCGGTTAAT
dNTPs eklenir ve 3’GGCCAATTACGA...
eklenme ışık No Reaction
oluşumu ile izlenir.
 Pyrodizileme– data
değerlendirilmesi

dTTP dGTP dCTP dATP dTTP dGTP dCTP dATP

TIME

AG Her bir noktadan ışık

oluşumu (flowgram)
DNA dizilerini
AC açıklar.
A pyrodizileme flowgram

Reprinted by permission from Macmillan Publishers, Ltd: NATURE copyright 2005. Margulies, M., et al., (2005)
Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors. Nature 437: 376-380.
 Diğer “gelecek generasyon”
dizileme yöntemleri

‘high throughput’, ve
‘massive parallelism’
yöntemler işgücünü ve
kimyasal kullanımını
azaltmaktadırlar.

Reprinted by permission from Macmillan Publishers, Ltd: NATURE Biotechnology Copyright 2008.
Shendure, J., and Ji, H. (2008) Next-generation DNA sequencing. Nature Biotech. 26: 1135-1145.
 Gelecek generasyon dizileme ile ,
epigenetik modifikasyonlar da tüm
genom düzeyinde incelenebirler:
EPİGENOMİK
GREEN =
H3K27me3
PURPLE =
methylcytosine

Abundance of siRNAs

Kasschau KD, Fahlgren N, Chapman EJ, Sullivan CM, Cumbie JS, et al. 2007 Genome-Wide Profiling and Analysis of Arabidopsis siRNAs. PLoS Biol 5(3): e57.
Zhang, X., Clarenz, O., Cokus, S., Bernatavichute, Y.V., Pellegrini, M., Goodrich, J., Jacobsen, S.E. (2007) Whole-genome analysis of histone H3 lysine 27
trimethylation in Arabidopsis. PLoS Biol. 5: e129.
Zilberman and henikoff (2007) Development 134, 3959
 Epigenetik/Epigenomik

ChIP-chip

http://www.nature.com/jid/journal/v125/n2/extref/5603467x1.jpg