|
 


   
 O   
‡Proteinler dışındaki ‡Proteinler çöktürülür.
moleküller karışımdan
uzaklaştırılır:
(TCA-NH4 sülfat-organik
Örneğin, ham özüte çözücüler kullanılarak)
streptomisin sülfat
eklenerek DNA
çöktürülür. Santrifüjlemeyle ayrılıp
ileri saflaştırma işlemleri
uygulanır.
Daha sonra da
santrifüjleme ile
uzaklaştırılır.
PROTEİNLER çoğunlukla

‡ Büyüklük ve şekil,
‡ Toplam yük,
‡ Yüzeyde bulunan hidrofobik gruplar,
‡ Kullanılan durağan faza bağlanma kapasitesi

gibi özelliklerinin farklı olmasına dayanarak




O   
ayrılıp saflaştırılabilir.
Kolon kromatografisi kolon
dolgu maddesi (durağan
faz, matris) ile
doldurulmuş alttan
musluklu basit bir cam
boruda gerçekleştirilebilir.
Protein karışımı uygun bir
elüsyon çözeltisiyle
kolonda sürüklenir.
Durağan fazla etkileşim
(adsorbsiyon) ve kolondan
ayrılma (dezorbsiyon)
özelliği bakımından farklı
proteinler belli zaman
aralıklarında veya
hacimlerde toplanarak
farklı fraksiyonlara ayrılır.
Kolondan çıkan fraksiyonların otomatik olarak belli hacimlerde toplandığı ve
absorbsiyonlarının ölçüldüğü 4 4
 de vardır. Böyle bir sistemde elüsyon
çözeltisi rezervuarla kolona gönderilebileceği gibi,  4

   ile sürekli
de beslenebilir. Kolondan geçen farklı fraksiyonlar
4    

tarafından ayrı kaplarda toplanır ve absorbsiyonları belirlenebilir ya da enzim
aktivitesi ölçülerek izlenebilir.
Kolon kromatografisinin farklı temellere
dayanan çeşitli tipleri vardır:
‡ Elektrik yükü veya hidrofobik grupların dağılımı gibi bazı
yapısal özelliklere dayanan:
‡      

4 
 
 
   

4 


 

4


‡ Protein ve dolgu maddesi arasındaki yapısal ve işlevsel
uyum ve etkileşim temeline dayanan:


 

4 


 

4 
 
4 
‡ Molekül boyutuna dayanan:
   

4 

4 
 
  de denir)
 Proteinleri oluşturan amino asitler farklı
yan zincirlere sahiptir. Aspartik ve
glutamik asit pH 7.0 değerinde negatif
yüklü asidik gruplar taşırken; lizin, arjinin
ve histidin pozitif yüklü bazik gruplar
içerir.
 aspartik asit glutamik asit

arginin
histidin

lizin
 Her protein, bu beş amino asiti farklı
oranlarda içerdiğinden, moleküllerin yükleri
de farklı (pozitif veya negatif) olur. Proteinin
net yükü yapısındaki bu amino asitlerin
miktarına ve protein çözeltisinin pH¶sına
bağlı olarak değişir.

Proteinler toplam yüklerinin 0 olduğu pH

değerinin (izoelektirik nokta, pI) üzerindeki
pH değerlerinde negatif, altındaki pH
değerlerinde ise pozitif elektrik yüküne
sahiptir.
 İyon değişimi
kromatografisinin
temelini, proteinin
yüklü grupları ile
katı matriks
arasındaki

 4



  
oluşturmaktadır.
§ yüklü iyon değiştirici § §

matrisler ANYON
§
§
§ §

DEĞİŞTİRİCİLER,
DEĞİŞTİRİCİLER §

- yüklü iyon değiştirici - -

-
matrisler KATYON -
-
-
DEĞİŞTİRİCİLER -
Proteinler, ya kullanılan tampon
çözeltisinin pH¶sını ya da tuz
konsantrasyonunu değiştirmek
suretiyle kolondan ayrılırlar.
Bir anyon değiştiricide negatif yüklü proteinlerin ayrılması. Kolon ayırımı yapılacak proteinle zıt
yükte olan dolgu maddesi (matriks) ile doldurulur. (a) Pozitif ve negatif yüklü proteinlerden oluşan
karışım kolona yüklenir. Zıt yüke sahip proteinler kolon dolgu maddesine adsorbe olurken,
matriksle aynı yükte olanlar kolonu terkederler. (b) Kolon içinde tutulmuş proteinlerin ayrılması
için, kolon NaCl çözeltisi ile yıkanır. Tuz iyonları (karşıt iyonlar, counter ions) matriks yüzeyindeki
yüklü gruplarla rekabet ederek ilgili proteinin kolondan ayrılmasına yol açarlar. Tuz
konsantrasyonunun kademeli olarak artırılması ile, daha fazla yüke sahip proteinlerin de kolonu
terketmesi sağlanır.
 O
  O

  de   de
yer alan § yüklü gruplar: yer alan - yüklü gruplar:
  



C2H4N§H3
SO3-

 
  

 4 

C2H4NH§(C2H5)2 CH2COO-

 
  

C2H4N§(C2H5)3
 Anyon değiştirici mi, katyon
değiştirici mi seçmeliyiz?

‡ Ayırmak istediğimiz proteinin pH stabilitesi

önem taşır.
‡ pI değerinin üzerindeki pH değerlerinde
(yani ± yüklü olduğu durumda mı daha
kararlı, yoksa pI değerinin altındaki pH
değerlerinde (yani § yüklü olduğu durumda
mı daha kararlı?
‡ Hangisinde daha kararlı ve dayanıklı ise
onu seçmeliyiz.
 pH 4-9¶un dışındaki pH
değerlerinde stabilitesini koruyan
protein sayısı azdır. Onun için
adsorban sayısı sınırlıdır. En çok
kullanılan adsorbanlar
4  4

 4 
  ve
 
  
  türevleridir.
  Proteinlerin ayrılmasında kullanılan iyon değişimi matriksleria,b.
  
     
  
  
 4 
 

 4  
  

4
4 4
4
|

AG 1 Kuvvetli AG 50W Kuvvetli
AG 2 Kuvvetli Bio-Rex 70 Zayıf
Bio-Rex 5 Orta
AG 3-X4A Kuvvetli
Bio-Rex MSZ 1-X8 Kuvvetli



Aminoetil sellüloz Zayıf CM-sellüloz Zayıf

DEAE-sellüloz Zayıf
Benzil DEAE-sellüloz Zayıf
ECTEOLA-sellüloz Zayıf
PEI-sellüloz Zayıf
QAE-sellüloz Kuvvetli
TEAE-sellüloz Zayıf
DEAE-sepasel (sephacel) Zayıf
   

 
 
DEAE-sefadeks Zayıf CM-sefadeks Zayıf
(A-25 veya A-50) (C-25 veya C-50)
QAE-sefadeks Kuvvetli SP-sefadeks Kuvvetli
(A-25 veya A-50) (C-25 veya C-50)


  


 
DEAE-sefaroz Zayıf CM-sefaroz Zayıf
CL-6B CL-6B
DEAE-sefaroz Zayıf CM-sefaroz Zayıf
(hızlı akışlı) (hızlı akışlı)
Q sefaroz Kuvvetli S sefaroz Kuvvetli
(hızlı akışlı) (hızlı akışlı)

aKısaltmalar: CM, karboksimetil; DEAE, dietilaminoetil; ECTEOLA, epiklorohidrin trietanolamin; PEI,

polietilenimin; Q, kuaterner amin; QAE, dietil-`2-hidroksipropil -aminoetil; S, sülfonat; SP, sülfopropil;
TEAE, trietilaminoetil.
bSephadex, Sephacel ve Sepharose Pharmacia tarafından üretilmektedir. Sellülozun çeşitli türevleri
Whatman, Sigma ve diğer bazı üretici firmalardan da sağlanabilir. AG ve Bio-Rex Bio-Rad firması
tarafından üretilen polistiren esaslı matrikslerdir. Başka firmalar da benzer maddeler üretmektedirler
(örneğin, Dow ("Dovex"), Rohm ve Haas ("Amberlite") gibi.
 Por özelliği önemli mi?


Çünkü bağlama kapasitesi etkilenir
MW10.000-100.000 proteinler için
DEAE-Sephacel veya ±Sepharose;
Daha büyük proteinler için Sephadex
A-25 veya C-25 kullanılır.
 İyon değişimi kromatografisinde

 
 
 .

 
Tamponlanmayan çözeltiler,
proteinler yerine, anyon
değiştiricilerin yüzeyinde OH> ve
katyon değiştiricilerin yüzeyinde H§
iyonlarının lokalize olmasına
 
 4 ) yol açar. Bu da
( 

olumsuz iyon değişimlerine ve
protein denatürasyonuna neden
olur.
‡ Bu teknikte sabit fazın (matrikse bağlı yan
zincirlerin) proteinlerle oluşturduğu hidrofobik
etkileşimlerden yararlanılır. Bu etkileşimin
derecesine göre farklı proteinler farklı
zamanlarda kolonu terkederler.
 Sabit fazdaki hidrofobik ligantlara örnekler

Örnek, yüksek derişimde tuz içeren (not:

denatürasyona yol açmayacak türden olmalı,
örneğin amonyum sülfat) bir tamponda
çözündürülerek kolona yüklenir. Proteinler
tampondaki tuz konsantrasyonu azaltılarak
kolondan ayrılır.
‡ Bu teknikte sabit
fazın (matrikse
bağlı yan
zincirlerin)
proteinlerle
oluşturduğu
metal
komplekslerinde
n yararlanılır.
 Örneğin, İmmobilize Metal
Afinite Kromatografisi (IMAC)
Bu teknik, |4  

O 
  olarak da
adlandırılan bir gup teknik içinde ele alınmaktadır.
Bu grubun diğer örnekleri ise:

Tiyofilik Adsorpsiyon
Kromatografisi (TAC)dir.

Boya Ligand Kromatografisidir.

Bu yöntem biyolojik
etkileşim temeline
dayanır ve bu
nedenle son derece
özgül ayırımların
yapılabilmesini
sağlar.
A (makromolekül) § B (ligand) A:B biyolojik yanıt

‡ Bu teknikte proteinler   adı verilen maddelere geri

dönüşümlü olarak bağlanırlar.
‡ Ligandlar, aktif taşıyıcıya kovalent olarak bağlanan ve
saflaştırılacak makromoleküle özel ve seçimli afinite
gösteren küçük moleküllerdir.
‡ Örneğin, antikor, bir enzimin inhibitörü, kofaktörü ve özel
hallerde substratı olabilir. Birçok ligand önce inert
destek metaryaline bağlanır ve kromatografi kolonuna
paketlenir.
‡ Bu sistemde sadece istenilen protein kolondaki liganda
bağlanır. Diğer proteinler bağlanmadan ayrılır. Daha
sonra kolonun uygun bir tampon ile yıkanması
sonucunda istenmeyen proteinler tamamen uzaklaştırılır.
Bir sonraki adımda ise tamponun uygun bir şekilde
değiştirilmesi ile liganda bağlanan protein kolondan geri
kazanılır.
Yöntemin,
ligand ile
ayrılacak
protein
arasındaki
etkileşimin
tipine göre
farklı
uygulamaları
vardır:
İmmobilize protein A veya
İmmobilize protein G veya
İmmobilize protein L içeren
kolonda ANTİKOR
saflaştırma yapılabilir.
I. Adım:İmmünoadsorban hazırlanır.
Antijenler (mavi) katı matrise (pembe
yuvarlaklar, selüloz, agaroz vb.) kovalent
olarak bağlanır (İMMOBİLİZASYON).
II. 2. Adım: Protein karışımı (ör. Serum)
kolondan geçirilir. Antijene afinitesi olan
antikorlar (kırmızı) antijene kovalent
olmayan etkileşimlerle bağlanacak ve
kolonu daha geç terkedecektir.
III. 3. Adım: Antijene tutunmuş antikoru
kolondan ayırmak için elüsyon sıvısı
(yüksek derişimde tuz içeren ve/veya
düşük pH¶da bir tampon) geçirilir.
IV. 4. Adım: Kolondan toplanan örneğin
(elüent) dializ edilerek tuzlardan
arındırılması
Bu yöntemde
proteinler
molekül
büyüklüklerinin
farklı olması
esasına göre
ayrılırlar.
Kolon dolgu maddesi küresel yapılı ve belirli
boyutta gözeneklere sahip inert jel
parçacıklarından oluşmuştur. Farklı boyutta
molekülleri içeren bir çözelti kolondan
geçirildiğinde, büyük moleküller gözenekli
taneciklerin aralarındaki boşluklardan
geçerek kolonda hızla ilerlerler; gözenek
boyutlarından küçük moleküller ise gözenek
içerisine diffüzlenir ve molekül küçüldükçe
artan bir alıkonma süresi ile kolondan
çıkarlar.
m
  

   



 

 

  


     

 


  

÷
   
   

÷
 
   

÷
  !
  " 


÷
   #

   

$    %&'  

&   &(  

& 

   &(  
Amino asitler, karbohidratlar, lipidler, nükleik
asitler, proteinler, pigmentler, streoidler ve
diğer biyolojik aktif moleküllerin ayrılmasında
ve tanımlanmasında çok iyi sonuçlar veren
bu teknik temelde otomatik hale getirilmiş
modern bir sıvı kromatografi tekniğidir.
 HPLC¶nin klasik sıvı
kromatografilerine göre önemli
üstünlükleri vardır:
‡ 1) çözünme (ayrıştırma) ve analiz hızı klasik
yöntemlerden çok yüksektir, 2) kolonları
yeniden doldurulmadan ve yenilenmeksizin
sürekli kullanılabilir, 3) ayırma gücünü etkileyen
değişkenler sıkı şekilde kontrol edilebildiğinden
tekrarlanabilirliği son derece yüksektir, 4) aletin
çalışması ve verilerin analizi kolaylıkla
otomatikleştirilir, 5) büyük boyuttaki (preparatif)
ayırım süreçlerine uygulanabilir.


 
4   |!
 |4 


 Waters  2795 |  $19,900
Waters 2795 Alliance HPLC is an integrated solvent and sample management
platform which combines two traditional high-performance liquid chromatography
(HPLC) components: a solvent management system and a sample management
system. ... more
 Kromatografik bir sistemde
hareketli faz gaz, durağan faz
da inert katı partiküller üzerini
kaplayan bir sıvı olduğunda
bu tekniğe 4
 

4 ya da kısaca
 

4 
denir.
Gaz kromatografisi temelde dağılım olayına
dayanır. Durağan faz, yüksek sıcaklık
derecelerine dayanıklı, paslanmaz çelik veya
camdan bir tüp (kolon) içine doldurulur. İnert bir
gaz (genelde helyum, azot veya argon) (hareketli
faz) yüksek basınç altında kolondan geçirilir.
Çalışılan materyale ait örnek buharlaştırılarak gaz
fazına sokulur ve durağan fazdan geçmesi
sağlanır. Örnekteki bileşenler hareketli faz ile katı
destek üzerindeki durağan sıvı faz arasında
dağılırlar. Durağan faza ilgisi olan moleküllerin
kolondaki hareketleri daha yavaş olur.
Gaz kromatografisi çok küçük moleküllerin son
derece iyi ayrılmasını sağlayan; basit, çok
yönlü, hızlı bir tekniktir ve çok duyarlıdır.
Bununla birlikte, bu kromatografideki en önemli
kısıtlama örneğin uçucu ve yüksek sıcaklık
derecelerine (200-250oC) dayanıklı olması
gerekliliğidir. Bu nedenle, gaz kromatografisi
ancak uçucu ya da uçucu türevi hazırlanabilen
moleküllerin ayırımında kullanılabilir.
"|

Code:#"|$
| $""""
"Hewlett Packard - 5890 Series II Gas Chromatograph with Packed
Inlet, O.I. Corp. PID/ELCD, O.I. Corp. 4560 Purge & Trap
Concentrator with MPM16 Autosampler (other options available),
Pentium IV Computer Data System with ChemStation. Tested
System with Six (6) Month Warranty, Installation and Training
Options are Available."