KANDAN GENOMİK DNA İZOLASYONU

• DNA hücre içerisinde

bulunduğu bölgede
yoğunlaşmış bir kitle
oluşturur.
• Paketlenmiştir
• RNA
• İki değerlikli katyonlar
• Di ve poli aminler
• Proteinler
• Her türlü hücreden DNA izole edilebilir:

1)Hücrelerin Parçalanması
2) DNA – Protein Kompleksinin Çözünmesi
3)DNA’nın ortamdaki Diğer moleküllerden
Uzaklaştırılması.
 1) HÜCRELERİN PARÇALANMASI
• EDTA (Etilen Diamin Tetra Asetikasit) lı tüpe alınmış
kandan 400 µl alınır.
• 1000 µl TE (Tris EDTA) eklenir.
• 12000 rpm de 1 dk santrifüj
• Süpernatant atılır. Dipteki hücrelerle aynı işlem üç
sefer tekrarlanır.
• Son yıkamadan sonra Hücrelerin Üzerine 320 µl TE,
90 µl NaCl, 80 µl SDS (Sodyum Dodesil Sülfat), 10 µl
Proteinaz K eklenir.
• 56 C de 1,5 saat veya 37 C de tam gece bekletilir.
 • EDTA ; Antikoaglükan maddedir.
• TE; Özellikle eritrositlerin parçalanmasında
kullanılan bir çözeltidir.
• SDS; bir deterjan türevidir ve özellikle hücre
zarındaki lipitleri uzaklaştırır.
• NaCl; tuz çözeltisi
• Poreteinaz K ; Proteolitik bir enzimdir.
 2) DNA PROTEİN KOMPLEKSİNİN
ÇÖZÜNMESİ
• Lizatın üzerine 250 µl Fenol 250 µl Kloroform
eklenir, karıştırılır.
• 2500 rpm de 2 dk. Santrifüj edilir.
• Üst faz başka tüpe alınır alt faz atılır.
• Üst faz ile aynı işlem iki sefer daha tekrarlanır.
• Fenol proteinleri degrede ederken, kloroform
gradient farkı yaratarak DNA nın fenol ve
parçalanmış etıklarla beraber dibe çökmesini
engeller.
 3) DNA nın DİĞER MOLEKÜLLERDEN
UZAKLAŞTIRILMASI
• Son fenol muamelesinden sonra farklı tüpe alınan
DNA içeren üst faz’a soğuk % 99 luk etanol eklenir
ve DNA çöktürülür.
• Soğuk etanolde DNA tüm diğer moleküllerden
(degrede olmuş veya olmamış RNA, protein
parçaları, fenol kalıntısı gibi) daha hızlı çökelir.
İZOLE DNA ‘ nın ANALİZİ
• SPEKTROFOTOMETRİK
• ELEKTROFORETİK
 SPEKTROFOTOMETRİK ANALİZ
• Nükleik Asitler 260 nm de maksimum
absorbsiyon gösterirler.

• Proteinler 280 nm de maksimum absorbsiyon

gösterirler.
SPEKTROFOTOMETRİK ANALİZ
SPEKTROFOTOMETRİK ANALİZ
• Optik Densite (OD)
• OD= 260 nm deki abs./280 nm deki abs.
• OD = 1,7 – 1,8 ise DNA saf
• OD= 2 ise kabul edilebilir sınırı
• OD=1 ise protein konteminasyonu
• OD< 0,5 ise DNA yok
 SPEKTROFOTOMETRİK ANALİZ
• Çift Zincirli DNA molekülü için 1 OD 50 µg/ml
ye karşılık gelmektedir
• DNA (µg/ml) = 260 nm abs. X 50 X Sulandırma
oranı.