VİRAL İNFEKSİYONLARDA TANI

Laboratuvar Tanısı

-Virolojik laboratuvar tanısında şu yöntemler

uygulanır :

 Virus İzolasyonu
 Direkt tanı
 Serolojik Tanı
 İndikasyon ve Yöntemler
 Hastanın tedavisinin devamını etiyolojik tanı
etkileyecekse, olayın kesin açıklanmasına ilişkin
epidemiyolojik bir merak varsa ve bilimsel incelemeler ve
araştırmalar çerçevesinde kesin tanı gerekiyorsa virolojik
tanı, temelde farklılıklar gösteren 3 yöntemle
gerçekleştirilir.

1)Genellikle hücre kültürlerinde olmak üzere etkenin canlı

bir konakta üretilmesiyle virüs izolasyonu,
2)Muayene maddesinde virüs partiküllerinin elektron
mikroskobuyla, virus antijenlerinin ise serolojik ve virus
genomunun moleküler biyolojik yöntemlerle saptanarak
virusun direk gösterilmesi,
3)Hasta serumunda antikor tayini.
 Virusların Laboratuvar Tanısı

Tanı şekli Yöntem Saptanan Olumlu ve

olumsuz
yönleri
İzolasyon Hücre İnfeksiyozite Yavaş,
kültürlerinde Patojenite duyarlı
üretmek vs. yöntemler.
Direkt Tanı Elektronmikro Virus Hızlı, fakat
skobisi EIA, partikülü daha az
IF vs. In-situ Antijen duyarlı.
veya filtre
Genom
hibridizasyon
Seroloji EIA, IF, RIA Antikor Retrospektif
vs.
 Virus İzolasyonu
 Muayene maddesinden aranılan virusa duyarlı
bir konağa ekim yapılarak virusun varlığı,
infeksiyozite ve patojenitesinin gösterilmesiyle
saptanır.

 Konakta bazı değişimlerin veya hastalık

belirtilerinin ortaya çıkması virusların varlığını
kanıtlar.
 Virüs İzolasyonu
Hücre kültürü Sitopatik etki (CPE)
Hemabsorpsiyon
İmmunfloresan
Embriyonlu yumurta CAM’da pocks
Hemaglütinasyon
İnklüzyon cisimcikleri
Hayvan deneyleri Hastalık
Ölüm
 Muayene maddesinin alınması ve transportu

 İncelenecek muayene maddesinin seçimi hastalığa

ve bulunması tahmin edilen virusa göre değişir.
 Muayene maddesinin erken alınması önemlidir.
 Önemli olan nokta, muayene materyallerinin
infeksiyonun erken dönemlerinde, zamanında,
yeterli miktarda, lezyonlu bölgelerden, mümkün
olduğu kadar aseptik koşullarda ve steril kaplar
(tüp, pepsi kutusu, kavanoz, özel kaplar, vs) içine
alınarak en kısa zamanda laboratuvara
gönderilmesi ve burada da hiç vakit geçirilmeden
işlenmeye alınmasıdır.
 Virusların, vücut dışında çok kısa olan yarılanma
ömürleri, buz içinde soğutularak uzatılmalıdır.
 Viruslar için kullanıma sunulmuş çeşitli ticari
transport besiyerleri vardır.
 Muayene maddesinin kuruması tehlikesi varsa,
transport besiyeri kullanımı özellikle önerilir.
 Laboratuvarların bilgilendirilmesi

 Laboratuvara yollanan muayene maddesinin ait

olduğu olgu için önemli olacak virusların
aranmasında klinik bulguların ve kuşkulu tanının
bildirilmesi özellikle önemlidir.
 Muayene maddesinin ön işlenmesi

 Muayene maddesinden konağa ekim yapmadan

önce, içerebileceği kontaminan bakterilerin
antibiyotikler, santrifüj ve nadiren filtrasyonla
uzaklaştırılması gerekir.
 Bazı ender durumlarda, örneğin
ultrasantrifigasyonla, virusların çoğaltılması da
denenebilir.
 Konak sisteminin seçimi

 Var olduğu düşünülen virus türüne göre

saptanır.
 Gözlem veya inkübasyon süresi ve buna bağlı
olarak tanı için gereken süre aranan virus türüne
bağlı olarak değişir.
 İdentifikasyon

 Hücrelerde izlenen değişimlerle ve nihayet biline

antikorların kullanıldığı, immunfloresan,
immunelektronmikroskobisi, EIA veya
nötrolizasyon testi gibi yöntemlerle serolojik
olarak gerçekleştirilir.
 Virus genomunun insitu veya filtrede
hibridizasyonla saptanmasına yönelik
yöntemlerde giderek daha sık uygulanmaktadır.
 Önemi ve anlamı

 Virusun anlamlı olup olmadığı virus tipine

bağlıdır.
 Olguların çoğunda virusun izolasyonu, hastalığın
etiyolojine ilişkin önemli bir kanıttır.
 Bazı olgularda ise latent viruslar, tümüyle başka
bir hastalık nedeniyle aktive olurlar ve doğal
olarak gözlenen hastalıkla bir ilişkileri olmadığı
halde muayene maddesinden izole edilebilirler.
 Virusların Direkt Gösterilmesi

Antijen gösterme İmmunfloresan, ELISA vb.

Elektron mikroskobisi Virus morfolojisi,

İmmun elektron mikroskobisi
Işık mikroskobisi Histolojik görünümler,
İnklüzyon cisimcikleri
Viral genomu Spesifik nükleik asit probları ile
gösterme hibridizasyon,
Polimeraz zincir reaksiyonu
(PCR), vd.
 Muayene maddesinin alınması ve transportu

 Elektron mikroskobisi için, negatif boyama

yöntemiyle incelenecek muayene maddesi, içine
hiçbir ilave yapılmaksızın seyreltilmeden
laboratuvara ulaştırılmalıdır.
 Antijenlerin saptanmasında immunfloresan yöntemi
uygulanması amacıyla alınan muayene maddesinden
hemen preparat hazırlanarak tespit edilir. EIA
yöntemiyle inceleme için özel ekstraksiyon ortamları
gerekmektedir.
 Genomun saptanmasına yönelik yöntemler için de
muayene maddesiyle ilgili olarak, in situ bir
yöntemin mi uygulanacağı yoksa önce ekstraksiyon
mu yapılacağına göre çeşitli kriterler göz önüne
alınmalıdır.
 Anlamı

 Duyarlılığın az olması nedeniyle elektron mikroskobisi

yöntemiyle elde edilen negatif bir sonucun anlamı azdır.
 Antijen ve genomun saptanması, elektron mikroskobisi
yöntemine göre daha duyarlı olmakla birlikte, bu
yöntemlerle yapılan incelemelerde kullanılan antikor
çeşidi veya nukleik asit probuna bağlı olarak yalnızca
belirli virusların selektif olarak saptanabileceği
unutulmamalıdır.
Virusun kültür yöntemleri veya biyokimyasal yöntemlerle
amplifiye edilerek saptanması :

 Amplifikasyon Kültürü : Virus, b,r hücre kültüründe

kısa bir süre için üretilir. Bu kültür sitopatik etkinin ortaya
çıkışından önce antijen ve genomun saptanmasına
yönelik yöntemlerle incelenir. Günümüzde bu yöntemin
sıklıkla “shell vial assay” olarak tanımlanmasının nedeni,
hücrelerin, kapaklı şişeciklerdeki lamellerde
üretilmesidir.Bu düzenekle yöntemin duyarlılığı, hücre
kültürü üzerindeki muayene maddesinin santrifüj
edilmesiyle arttırılmaktadır. En büyük zaman kazancı,
tabii, infeksiyon siklüsünde oluşan virusa özgü erken
proteinlerin saptanmasıyla sağlanmaktadır. Bu nedenle
bu yöntemle özellikle erken antijenler aranır.
 Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR)

 Virus genomunun saptanması amacıyla

uygulanan bu yöntemle duyarlık çok artmaktadır.
Hastaya ait muayene maddesinden nükleik asit
izole edilir. Olasılıkla bunun içinde bulunan virus
genomunun, RNA-virusları söz konusu
olduğunda, önce revers transkriptazla DNA’ya
transkripsiyonu sağlanır. Bu DNA, aynı DNA
viruslarının DNAsında olduğu gibi, bir DNA-
polimeraz ile in vitro koşullarda şu şekilde
çoğaltılır:
 DNA nın çift ipliği sıcaklık uygulanarak denatüre
edildikten sonra, aranılan virus genom parçasının
her iki ucuna komplementer olan ve böylelikle
buralarda hibrit oluşturabilecek iki sentetik
oligonukleotit ortama ilave edilir. her seferinde önde
bulunan kalıp DNA, ortama polimeraz ilavesiyle
kopyalanır; bu sırada oligonükleotitler primer olarak
iş görürler. Eski ve yeni zincirler tekrar ısıtılarak
ayrılırlar ve reaksiyon yeniden başlatılır. Bu
reaksiyon zincirinin pek çok kez tekrarlanmasıyla,
örnekte bulunan esas viral DNA miktarı binlerce kez
çoğaltılmış, yani amplifiye edilmiş olur. Yeni
sentezlenen DNA zincirleri 2. generasyondan
itibaren, birimsel, tanımlanmış bir uzunluğa
sahiptirler ve bu nedenle jel elektroforezle
gösterirler. Reaksiyonun özgüllüğü bu DNA
zincirlerinin dizilerinin, örneğin hibridizasyonla,
sınanmasıyla kontrol edilir.
polimeraz zincir reaksiyonu
 Serolojik Tanı
 Bir virus infeksiyonu, humoral bağışıklığa yol açtığında
oluşan antikorlardan serolojik tanı amacıyla yararlanılır.
 Serolojik bulguların yorumlanmasında,
değerlendirilmesinde, gözlenen reaksiyonların yeni bir
infeksiyonu mu yoksa ilgili bir virusla eski bir ilişkiyi mi
göstermekte olduğuna karar vermek gibi bir sorunla karşı
karşıya kalınmaktadır.
 Bu karar için 2 kriter yol göstericidir :
 IgM’lerin Saptanması (IgG’ler olmaksızın) : Henüz
geçirilmekte olan, yeni bir primer infeksiyonunun kanıtıdır.
Sadece IgM’leri saptayabilmek için, hastalığın çok erken
dönemlerinde kan alınmalıdır. Kan örneğinin gecikilerek
alınması, IgG ve IgM lerin eş zamanlı gösterilmesi yeni bir
infeksiyonu işaret eder. Yine de IgM lerin saptanması
latent bir infeksiyonun reaktivasyonuna veya bir
anamnestik reaksiyona da işaret edebilir. Bu 2 durumda
da IgM ler oluşmaktadır.

 Hastalık Seyri Sırasında ; IgG titresinde, 10-14 gün

içinde en az dört kat artış ve daha sonra aynı oranda
büyük düşüş önemli bir kanıt olarak kabul edilmektedir.

.
 NOT:

 IgM ler günümüzde, spesifik olarak insan ıgM lerine karşı

hazırlanmış bağışık serumların kullanıldığı bir EIA testi
olan Capture-test ile saptanmaktadır