MOLEKÜLER BİYOLOJİDE

KULLANILAN YÖNTEMLER I
DERS 6

Prof. Dr. Şule ARI

Moleküler Biyoloji ve Genetik
Bölümü
2005-2006
DNA ÇOĞALTILMASI
In vitro DNA çoğaltılması;
 ilgilenilen bir DNA parçasının (genin)
bol miktarda eldesi,
 bu DNA’nın analizi
 genetik mühendisliği
çalışmaları için gereklidir
Doğal hücre çoğalması
REPLİKASYON
 Hücre bölünmesi sırasında DNA
miktarının 2 katına çıkması
 Jenerasyonlar boyunca DNA miktarının
başlangıca göre üssel artışı
 30 jenerasyon sonunda milyar kat artış
REPLİKASYON
In vitro DNA çoğaltılması

1. Rekombinant DNA teknolojisi

70’li yıllarda gelişen teknoloji

2. PCR, Polymerase Chain Reaction,

PZR, Polimeraz Zincir Reaksiyonu
80’li yıllarda gelişen teknoloji
In vitro DNA çoğaltılması
Rekombinant
DNA teknolojisi

gen klonlaması
PCR
PCR istenilen bir DNA parçasının
replikasyon sürecinin taklit edilmesiyle
birkaç saatte milyar katının
kopyalanmasıdır
PCR belli bir DNA parçasının primerlerin
yönlendirmesiyle enzimatik olarak
sentezlenmesini sağlayan in vitro bir
yöntemdir
PCR
PCR , 1986 – Cetus
PCR’ın muciti Kary Mullis, 1993’de
Nobel Ödülü’nü alırken….
PCR
KULLANIM ALANLARI:
1. Temel moleküler biyolojik
çalışmalar
 Klonlama
 Dizi analizi
 DNA haritalaması
PCR
KULLANIM ALANLARI:
2. Tıpta hastalık tanısı
 genetik hastalıklar (orak hücre anemisi,
kistik fibroz, fragile X, lösemi vb.)
 infektif hastalıklar (AIDS, tüberküloz, vb.)
 prenatal tanı
PCR
KULLANIM ALANLARI:
3. Tıpta allelik dizi varyasyonlarının
belirlenmesi
 organ transplantasyonu için uygun doku tipinin
belirlenmesi
 adli örneklerin genetik tiplendirilmesi
(analık-babalık testi)
 hastalıkların genetik temelinin araştırılması
 mutasyon taraması
PCR
KULLANIM ALANLARI:
4. Tarım & Hayvancılık
 Verim,dayanıklılık vb. tarımsal özelliklerce
elit tiplerin seçimi
PCR
KULLANIM ALANLARI:
5. Sistematik & Evolusyon
 Tür tanısı, türler arası akrabalık ilişkilerinin
belirlenmesi, türlerin kökenlerinin
araştırılması
PCR
TANIMLAR:
Replikasyonun in vitro olarak
gerçekleştirilmesi

Özgün bir DNA parçasının milyarlarca

kopyasının primerlerce yönlendirilerek in
vitro koşulda enzimatik sentezi
PCR
 Bir dizi sentez reaksiyonu içerir, bu
nedenle polimeraz zincir (zincirleme)
reaksiyonu adını alır.
 Reaksiyon iki primerin hedef DNA
bölgesinde bağlandıkları diziler arasında
ve termostabil DNA polimeraz enzimi
tarafından katalizleme esasına dayanır
PCR
1 PCR DÖNGÜSÜ

1- Denatürasyon
2- Primerin bağlanması (annealing)
3- Uzama (sentez)
aşamalarından oluşur
PCR
1- Denatürasyon:
Çoğaltılacak DNA parçasının yüksek
sıcaklıkta iki ipliğinin birbirinden
ayrılması
Tek iplikli DNA’ların oluşumu
92-95oC
PCR
2- Primerin bağlanması (annealing):
Denatürasyondan sonra sıcaklık
düşürülür ve primerlerin tek iplikli
DNA’da kendilerine özgün dizilere
bağlanması sağlanır
55-60oC
PCR
3- Uzama (sentez):
Termostabil DNA polimerez primerlere
bağlanır ve 3’ uçlarına kalıba uygun
nükleotidleri ekleyerek DNA sentezi
yapar
72oC
PCR
 Sentez üsseldir 2n
ÖR: 30 döngü sonunda 230 kat DNA
artışı olur
 40 döngüden fazlası istenmez
 30 döngüden sonra istenmeyen ürün artışı
olur
 Enzim miktarı kısıtlanır
 Hedef dizi artışı ile primerler rekabet eder
PCR BİLEŞENLERİ
1- Kalıp DNA: çoğaltılmak istenen diziyi içeren
DNA
 Her çeşit organizmaya ait kromozomal ve
ekstrakromozomal DNA
 Genomik DNA kitaplıkları
 RNA
 cDNA
 Herhangi bir biyolojik materyale ait DNA örneği
PCR BİLEŞENLERİ
2- Primer molekül: çoğaltılmak istenen
bölgenin sınır dizilerine tamamlayıcı tek
iplikli kısa DNA parçaları
 20 ya da daha aza nükleotidden oluşurlar
 Bilgisayarlar ile tasarlanırlar
 Ticari olarak elde edilirler
PCR BİLEŞENLERİ
3- DNA polimerazlar: Termostabil özellikte
 Önceleri E.coli DNA polimaraz I Klenow
fragmenti kullanıldı
 Thermus aquaticus Taq DNA polimeraz’ı
70-80oC’da aktif, saniyede 37-100 nükleotid
ekler
 Günümüzde rekombinant DNA polimerazlar
da (AmliTaq, Pfu polimeraz, Vent vb.)
kullanılmakta
PCR BİLEŞENLERİ
4- Deoksinükleotid trifosfatlar
(dNTP’ler):DNA yapıtaşları
 Yüksek saflıkta ve ticari olarak elde edilirler
 Ayrı ayrı ya da karışım halinde bulunurlar
 Genellikle 100l’lik konsantrasyonda
kullanılırlar
 Konsantrasyonları döngü sayısına, gen
boyutuna, MgCl2 konsantrasyonuna ve
primer miktarına bağlıdır.
PCR BİLEŞENLERİ
5- MgCl2 MgCl2 ve tampon: Tamponda genellikle Tris-
HCl, KCl, MgCl2 bulunur. Kullanılan enzime göre
tampon içeriği değişebilir.
 Mg+2 iyonu dNTP’lerle geri dönüşümlü kompleksler oluşturur,
koenzim olarak enzim aktivitesini uyarır
 DNA’nın Tm değerini artırır
 Genellikle 05-5mM kullanılırlar; fazlılığı spesifik olmayan ürün
artışı ile yetersizliği verim düşüklüğüne neden olur
 Mg+2 konsantrasyonu optimize edilmelidir
PCR ÇEŞİTLERİ
 Anchored (demirlenmiş) PCR: çoğaltılacak DNA’nın sadece
bir bölgesinin dizi bilgisi olduğunda
 Nested (yuvalanmış) PCR: özgün olmayan dizilerin
çoğaltılmasını engellemek için
 Inverse (ters) PCR: bilinen bir diziden yararlanarak bu dizinin
iki ucundaki bilinmeyen bölgenin çoğaltılmasında
 In situ PCR: hücre,doku organdaki DNA’nın çoğaltılmasında
 Multiplex (çoklu) PCR: birden fazla bölgenin aynı anda
çoğaltılmasında
 Revers (geri) PCR –RT PCR: RNA’dan DNA çoğaltılmasında