Pruebas para identificación

de bacterias
Pruebas para Staphylococcus
Dnasa

 Fundamento: Se utiliza para la detección de desoxirribonucleasas

(Hidrolizan ADN)
 Siembre: Se realiza un cuña
 Positivo: Halo trasparente alrededor de siembra con cuña
Aglutinación para Proteína A

 Colocar un gota del reactivo de Tapa Amarilla en un Carton, luego tomar

de 4 a 5 colonias de Staphylococcus y mezclar esparciendo en todo el
cartón. Luego de unos 20 segundos mezclando se debería observar lo
siguiente.
Pruebas para Streptococcus
y Enterococcus
Novobiocina
Polimixina B
Bacitracina
Optoquina
 Son ATB que se utilizan como pruebas de identificación y que se prepara
igual que cuando se hace antibiograma.
 Novobiocina: Halo mayor o igual a 16mm se considera sensible
Polimixina B: Halo mayor o igual a 10mm se considera sensible
Bacitracina: cualquier halo de inhibición se considera (sensible)
Optoquina: Sensible, cuando hay inhibición alrededor del disco. Se
considera como punto de corte 16 mm. (discos de 10 mm) o 14 mm (discos
de 6 mm)

Optoquina de5 µg
Hidrólisis
de Esculina
 La esculina contiene un carbohidrato unido a un compuesto aromático.
Este test se usa a menudo para distinguir especies de Streptococcus de
enteroccoco.
Se crecen las bacterias en un medio complejo que contiene 0,01 % de
esculina y un 0,05 de citrato férrico.
 Crecimiento en Nacl 6.5%

La prueba de tolerancia a la sal (caldo con 6.5% de NaCl) diferencia las especies de Enterococcus de los
Streptococcus del grupo D no enterococos (Streptococcus bovis).

FUNDAMENTO
Se basa en la capacidad de la bacteria de desarrollarse en presencia de cantidades variadas de cloruro de
sodio (NaCl). Es una propiedad que ha sido utilizada para caracterizar varios géneros y
especies bacterianas, incluyendo los Streptococcus del grupo viridans. En este caso se utiliza la
concentración de Cloruro de Sodio al 6,5%.
Telurito

 Es prueba se realiza directamente en el Agar Telurito.

 Se realiza la siembra, pero no tipo aislamiento si no mas bien una estria al
medio de la placa en dirección hacia abajo.
 Positivo: Crecimiento en el agar con un color negro
Negativo: Crecimiento sin incoloro
Arabinosa

 Esta prueba se realiza con un diatabs. Se utilizan 250ul de suero fisiológicoy

se llevan a 4 Mc farlan y luego se debe colocar disco.
 Según lo que diga la tabla se deberá añadir algún otro componente
(como para revelar la prueba)

 Positivo
Hipurato de sodio

 El hipurato es un compuesto orgánico aromático que puede ser

hidrolizado enzimáticamente originando benzoato y glicina. Este test se
usa a menudo para diferenciar especies de Streptococcus.
 También ser realiza por Diatabs. 250ul de suero fisiológico a 4 Mc farlan y
colocar disco.
 Solubilidad biliar
 Se prepara 1 ml de una suspensión densa en solución fisiológica de un
cultivo puro. Se divide en dos partes iguales en tubos separados. A uno de
ellos se le agregan 0,5 ml de una solución de desoxicolato de sodio al 10 %
y al otro 0,5 ml de solución fisiológica. Se incuba hasta 3 hs y se observa
cada 15 minutos
 Test de camp y camp reverso
 Se basa en que los Streptococcus del grupo B producen un factor llamado
CAMP (factor de monofosfato de adenina cíclica) que aumenta la zona
de hemólisis producida por un Staphylococcus productor de ß-lisina.
 Se realiza estriando un cultivo de estreptococo ß-hemolítico en forma
perpendicular a una estría de un estafilococo productor de ß-lisina en agar
sangre. Se incuba 18-24 horas a 37ºC.
 LAP “leucin aminopeptidasa”

 Con las pinzas, poner el disco en un portaobjetos limpio o en la tapa de una

placa de agar que no tenga una humedad excesiva. Humedecer ligeramente
el disco con 5-10 ul de aguadesmineralizada usando una micropipeta ajustable
o un asa de inoculación de 10, NO SOBRESATURAR. Como alternativa, el disco
se puede colocar en la superficie de agar del medio usado en la placa para
rehidratación. Coger la “pasta” visible de un cultivo de 18-72 horas usando un
asa estéril o una varilla aplicadora de madera. Frotar suavemente el inóculo en
una pequeña zona del disco. Incubar a temperatura ambiente durante 5
minutos. Añadir 1 gota de reactivo de desarrollo de color al disco. Dejar hasta
un minuto para el cambio de color.
 Prueba positiva - desarrollo de un color de rosa a rojo un minuto después de
aplicar el reactivo de desarrollo de color.
 Prueba negativa - sin cambio de color o desarrollo de un color crema o
amarillo un minuto después de aplicar el reactivo de desarrollo de color.
 Lecitinasa
 Esta prueba se realiza para determinar la capacidad de los
microorganismos para producir la enzima lecitinasa. Realice un aislamiento
o una estría en una placa de agar yema de huevo con el microorganismo
a identificar. Incube durante 1 a 4 días a la temperatura óptima de
crecimiento del microorganismo. Una prueba de lecitinasa positiva,
consiste en la aparición de una zona opaca alrededor del crecimiento
microbiano, como resultado de la hidrólisis de la lecitina de la yema de
huevo.

Positivo Negativo
Aglutinación para Streptococcus

 Primero se deben tomar cierta cantidad de ul de enzima que viene en el

kit y dejar en un tubo Khan. Luego colocar de 4 a 5 colonias e incubar a
37°c por 10 minutos. A los 5 minutos mezclar la suspensión y volver incubar.
 Luego del tubo Khan que preparamos colocamos un gota en el Cartón
para aglutinar y luego el Reactivo (según la sospecha que tenemos.
Puede ser grupo A;B;C…) y esparcir en el circulo con un palito que viene
en el kit.
 Después de mezclar durante 20 segundo dando giros, se observara lo
siguiente:
PYR

 Primero en un carton debemos dejar colonias en el lugar con un palito.

Luego de esto se coloca el Buffer y se incuba durante 5 minutos. Pasado
los 5 minutos se agrega el reactivo PYR y se debería observar lo siguiente.

 PYR positivo da entre rosado y morado

Pruebas especificas para
Streptococcus viridans
Pruebas especificas
para Streptococcus
viridans
 Hidrolisis de Urea: Es realizada con
el tubo en pico de flauta

 Producción de Acetoina

 Acidificación de Sorbitol
Arginina

 Se debe prepara un tubo con suspensión bacteriana con 250ul de suero

fisiológico o solución salina utilizando como minimo 4 McFarland. Se añade
Diatabs y 3 gotas de aceite de parafina, cerrar tubo e incubar a 35-37
grados.
 Positivo debería dar de color rojo
 Negativo debería dar de color amarillo
VP (voris postcawer)
 Esta prueba se realiza para
determinar la capacidad de un
microorganismo de fermentar la
glucosa con producción de un
producto final neutro (acetoína) por
la vía butanodiólica.

Inocule con el asa transfiriendo una

porción de cultivo puro a un Tubo de
Caldo Voges Proskauer. Incube a 35°C
por 24 a 48 horas. Transcurrido el
tiempo de incubación a 1 mL de
cultivo añada 12 gotas (± 0,6 mL) de α-
naftol al 5% en etanol y 4 gotas (± 0,2
mL) de KOH al 40%, agite y deje reposar
por 5 a 10 minutos
Enterobacterias
Aglutinación para E.coli O139
Aglutinación para Salmonella

 En esta aglutinación se debe realizar a partir de un agar especial (no

recuerdo cual es). En la aglutinación que yo observe se hace una
suspencion lechosa en unos 300 a 500ul de suero fisiológico normal
(debería ser suero formolado) como para alcanzar a aglutinar los distintos
reactivos. En un porta objeto se agrega una gota de un suero polivalente
en donde si ese presenta aglutinación correspondería a una Salmonella.
Los demás sueron nos indicarían el tipo de salmonella especifico a cual
correspondería nuestra sepa. (De los sueros que recuerdo estaba en B y el
D que no recuerpo muy bien lo que indicaban) Para que sea positiva en el
porta objeto se deberían ver grumos.
Aglutinación para Shigella
Levadura y hongos
Tinta china
LEVADURAS
clamidoconidios terminales
Blastoconidios unicos
Ascosporas

 Sembrar la levadura en estudio en agar V8 o Gzapek e incubar a 250C.

durante 7 a 10 días. Luego, realizar frotis, teñir por el método de Ziehl
Nielsen y observar con objetiva de inmersión.” Saccharomyces, Pichia y
Hansenula.”
Auxonograma

 Auxanograma o asimilación de fuentes de carbono y nitrógeno

 Preparar suspensión de la levadura en estudio, ajustando la turbidez de

acuerdo al patrón 5 de la escala de Mac Farland. La proporción de inoculo v/s
medio de cultivo es 1 para 10. Fundir el Medio C y medio N, estabilizando su
temperatura a 50ºC. en baño María. Para verificar la asimilación de azúcares
mezclar 4 ml de suspensión en levaduras del género Candida spp. Con 40 ml
de medio C y trasvasar a placa grande de 150 mm de diámetro. Para otras
levaduras, usar un inoculo menor de 2 ml, para 20 ml de medio C y colocar en
placa de Petri. La diferencia en el tamaño de la placa se debe a la cantidad
de azúcares a ser testados. Para observar asimilación de fuentes de nitrógeno,
se mezcla 2 ml del inoculo con 20 ml del medio N y se vierte en placa de Petri.
Es importante homogeneizar inmediatamente y dejar reposar para que
solidifique, en un lugar plano. Luego, distribuir en forma equidistante los
carbohidratos a ser testados sobre el medio C + levadura y las fuentes de
nitrógeno sobre el medio N + levadura. Incubar a 25ºC, durante 24 a 72 hrs.
Zimograma o fermentación de
hidratos de carbono
 Preparar suspensión de la levadura en estudio, ajustando la turbidez de
acuerdo al patrón 5 de la escala de Mac Farland. Inocular 200 l de la
suspensión en tubos de ensayo que contienen los respectivos azucares.
Incubar a 37ºC por 24 a 48 hrs. Algunas especies presentan fermentación
tardía. Los azúcares utilizados son glucosa, galactosa, lactosa, maltosa,
sacarosa y trehalosa. Realizar la lectura observando la producción de
ácido y gas, evidenciada por cambio del color del medio, debido al
indicador de pH y al acumular gas en el interior del tubo de Durhan
invertido. La observación es válida hasta 20 días después de realizada.
 Auxonograma v/s zimograma

La habilidad de una levadura para fermentar un

La prueba de Auxanograma, indica la habilidad de
determinado azúcar depende de la presencia o
una determinada levadura para utilizar un
ausencia de un sistema de transporte que permite la
compuesto en presencia de oxígeno, como única
absorción del carbohidrato en tensión de oxígeno y
fuente de carbono o nitrógeno. La mayoría de las
de la presencia de un sistema enzimático que actua
especies posee un perfil propio de asimilación que
en la degradación glicolítica del azúcar con
facilita la correcta identificación de la levadura. Esta
formación de etanol y anidrido carbónico (CO2). El
prueba está condicionada a factores de
resultado de esta prueba es complementario y
permeabilidad, sistemas enzimáticos que catalizan y
ayuda en la diferenciación de especies, cuando un
degradan los hidratos de carbono y a sistemas
perfil de auxanograma es presentado por más de
reductasa que intervienen en la reducción del
una especie de levaduras.
nitrato a nitrito.
Tubo germinal

 Un cultivo fresco de 24 o 48 hrs se siembra en un tubo estéril con 0,5ml de

suero humano o de animal y se incuba por 2 a 3 hrs a 370C. Luego con
pipeta Pasteur se deposita una gota de la suspensión sobre un portaobjeto
y se agrega un cubreobjeto. La preparación es examinada con objetivas
de 10X y 40X.
 Resultado positivo: Presencia de levaduras con prolongación fina de
paredes paralelas. Esta no es septada y sin constricción en la base de
unión a la célula madre.
 Falso positivo: Primordio de pseudohifa. El tubo germinativo difiere del
primordio de pseudohifa, porque este último no tiene paredes paralelas y
constricción en la base de unión a la levadura madre, además puede
presentar septo.
Microcultivo :permite observar las características micromorfológicas de
las levaduras, tales como presencia de blastoconidios, pseudohifas, clamidoconidios,
hifas, artroconidios, entre otros.

 Se prepara una cámara húmeda (placa de Petri) compuesta de papel

filtro, soporte y cubreobjeto. Sobre el curbreobjeto se depositan 2,5 a 3ml
de agar maíz o arroz con tween 80 al 1%, previamente fundido a baño
María. Después de solidificar el medio, con auxilio de una asa fina, se
realiza siembra en estrías finas y paralelas, al menos tres, en la superficie del
medio. Luego se agrega un cubreobjeto estéril protegiendo los bordes de
las estrías, ya que este será el lugar escogido para observar el microcultivo.
Humedecer la cámara con 2,5 a 3 ml de agua destilada estéril e incubar a
250C, por 48 a 96 hrs. Examinar al microscopio con objetivas de 10 y 40X.
Cromocandida
Filamentosos
flavus
Fumigatus
terreus
NIGER
Muestra con KOH
Bacilos NO fermentadores
 Oxidasa
 La presencia de citocromo C oxidasa en la cadena de trasporte de e- puede detectarse utilizando
un aceptor de e- artificial p-fenilendiamina. Este test se usa para diferenciar pseudomonas (positivo)
de enterobacterias (negativo)
Se impregnan discos de papel con parafenilandiamina y se coloca en un cultivo creciendo en
placas de agar nutritivo.
 Se utiliza palito para sacar colonias. Una reacción positiva cambiara de color dentro de los 10
primeros segundos. De no haber cambio de color durante este tiempo se toma como Oxidasa
negativo

La oxidasa se utiliza
para separar entre
Pseudomona,
Burkholderia y
anginosus que son
Oxidasa + de los
negativos que son
Acinetobacter y
Stenotrophomonas
Dnasa

 Fundamento: Se utiliza para la detección de desoxirribonucleasas

(Hidrolizan ADN)
 Siembre: Se realiza un cuña
 Positivo: Halo trasparente alrededor de siembra con cuña
 O/F
 En condiciones aerobias las bacterias pueden oxidar la glucosa hasta CO2 gas. El oxígeno es el
aceptor final de e- en el metabolismo respiratorio. en condiciones anaerobicas en ausencia de un
aceptor de e- como nitrato, las bacterias sólo pueden utilizar la glucosa por vía fermentativa. En
este test se evalúa la capacidad de las bacterias para oxidar y/o fermentar produciendo ácido
que se detecta gracias al azul de bromotinol (indicador de pH) Es útil en la distinción de
pseudomonas y enterobacterias.
Se inoculan tubos de medio con asas de punta recta. Uno de los tubos se recubre con vaselina
para aislarlo del oxígeno (tubo de fermentación) y otro no (tubo de oxidación)
 Hidrólisis de gelatina
 La mayoría de los polímeros son demasiado grandes para ser transportados dentro de las células. Las
bacterias excretan enzimas extracelulares que hidrolizan esos polímeros transportando al interior de la
célula en monómeros que les sirven para crecer.
La producción de proteasas es evaluada por incorporación de una proteína (gelatina o caseína) en
un medio sólido en placa. La placa se inunda con ácido que precipita la proteína no hidrolizada.
Movilidad o motilidad
 Esta prueba es realizada por gota pendiente para ver si la bacteria posee
movimiento. Tener cuidado con el movimiento Braubrowniano que
puedan tener.
 Primero sobre un cubre objeto de tamaño mediano, se agrega una gota
de suspensión bacteriana que se realiza con suero fisiológico y bacterias.
Lueo en el porta objeto que tiene una superficie cóncava se coloca sobre
nuestra gota que dejamos en el cubre objeto y después procedemos a
revisar en microscopio con aumento de 40X.
Crecimiento a 41°C

 Crecimiento a 41°C se realiza en un medio de color blanco. Este se realiza

para determinar la termoresistencia al calor que posee la bacteria.
 Bacterias como Acinetobacter baumaniii y Pseudomonas aeruginosa
posee crecimiento a esta temperatura.
Arginina

 Se debe prepara un tubo con suspensión bacteriana con 250ul de suero

fisiológico o solución salina utilizando como minimo 4 McFarland. Se añade
Diatabs y 3 gotas de aceite de parafina, cerrar tubo e incubar a 35-37
grados.
 Positivo debería dar de color rojo
 Negativo debería dar de color amarillo
Fastidiosos
Hamophilus influenzae

 Catalasa + Lactosa – Fermentación de azucares:

En un tubo con 250ul de suero a 4
 Oxidasa + Sacarosa – McFarland agregar el respectivo disco
 Glucosa + Maltosa - e incubar.

 Urea + (Se realiza con tubo pico de flauta)

Betalactamasa
 Para determinar si tiene betalactamasa se realiza a través de un disco de
nitrocefin.
 Primero se colocas el disco (color amarillo grande) en un porta objetos.
 Luego se humedece con una gota de agua
 Una vez humedecido se agrega colonias con un palito y se espera que
cambie de color.
 SI hay un cambio de color visible y notorio se considera positivo para
betalactamasa.
 Satelitismo
 Primero se debe realizar la siembra de nuestra muestra en estudio en un
agar sangre con 0,5 McFarland. Luego se en una línea al medio de la
placa se agrega una cepa de Staphylococcus aureus ATCC hemolítica y
se deja incubar toda la noche.
 Al día siguiente se debería ver crecimiento del fastidioso en estudio
alrededor de las cepas de Staphylococcus aureus, lo que correspondería
a un resultado positivo.
Pruebas de factores
X, V y X+V
 En esta prueba se busca diferencias
Haemophilus spp. Esta prueba es
realizada en una Agar Mueller Hinton.
Primero se realiza la siembra de la cepa
con 0,5 McFarland. Luego se colocan los
discos X (hemina), V (NAD) separados
por 2 cm entre si y el X+V alejado de
ambos factores. Terminado el
procedimiento se incuba de 18 a
24horas a 35-37°C.
 Si al día siguiente existe crecimiento
alrededor de los factores X+V significa
que nuestra cepa correspondería a un
Haemophilus influenzae
Aggregatibacter aphrofilus

Fermentación de azucares:
 Catalasa + Sacarosa + En un tubo con 250ul de suero a 4
 Glucosa + Lactosa + McFarland agregar el respectivo disco
e incubar.
 Factores X, V y X+V Satelitismo
Pasteurella (Es un cocobacilo. Sospecha con
mordedura de animal)

 Catalasa + TSI A/A Nitritos +

 Oxidasa + Sacarosa + Ornitina + (Se realiza con MIO)
 Glucosa + Maltosa +
 Urea +
(Se realiza con tubo pico de flauta)
Fermentación de azucares:
En un tubo con 250ul de suero a 4
McFarland agregar el respectivo disco
e incubar.
 Nitratos
 Para esta prueba se debe sembrar la bacteria en un tubo
pico de flauta especifico. Se deja incubar y al otro día se
le agregan dos reactivos de forma simultanea (reactivo
ATB). Si nuestro agar da un color rojo a rosado indicaría
una prueba positiva para reducción de nitratos.

Positivo

 Si no se presenta el cambio de color se le debe agregar

polvo de Zn (una cantidad considerando la cantidad de
reactivo) SI se presenta un cambio de color una vez
agregado el Zn nos indicaría que no hubo reducción de
nitratos lo que se traduce a una prueba negativa. En
cambio, si no se genera cambio de color cuando se
agrega Zn se consideraría positivo para la reducción de Negativo Positivo
nitratos.
Bordetella (Es un
bacilo)

 Oxidasa +
 Catalasa
 Motilidad +
 Nitratos +
 Api
Moraxella

 Catalasa + Citrato -
 Oxidasa + Motilidad +
 Gelatina + DNAsa+