Enzimas y

Células
Inmovilizadas
EQUIPO 04:
AVILA SANCHEZ TALIA
FERNANDA.
LARA LOPEZ LIZET
GUADALUPE.
BELTRAN PEREZ LETICIA.
DIAZ ORTEGA MIGUEL ANGEL.
LUNA RODRIGUEZ MAURICIO.
Un poco de historia….
• Uso de enzimas se inició, en 1875, con la producción de renina a
partir de estómagos de ternero para la fabricación de queso.
• En 1890 a partir de Asperigillus oryzae, se generó la takadiasa,
que es mezcla de amilasas y proteasas utilizadas como ayuda
digestiva.
• En 1913, se reportó la producción de amilasas de Bacillus
subtillis para ser usadas en la industria textil.
• En 1955,, primer escalamiento industrial, con la producción de
glucoamilasa a partir de Asperigillus oryzae o Rhizopus sp. A
pesar de estos avances en la utilización de las enzimas de origen
microbiano, el principal desarrollo de la industria se dio con la
incorporación de las proteasas en los detergentes, durante los
años sesentas.
 ENZIMAS.
• Las enzimas son biomoléculas
especializadas en la catálisis de las
reacciones químicas que tienen lugar en
la célula.
• Son muy eficaces como catalizadores, ya
que, son capaces de aumentar la
velocidad de las reacciones químicas
mucho más que cualquier catalizador
artificial.
• Son altamente específicos, debido a que
cada uno de ellos induce la
transformación de un sólo tipo de
sustancia y no de otras que se puedan
encontrar en el medio de reacción.
 XX
Obtención de enzimas
Ventajas
• Alta velocidad de síntesis
• Elevado rendimiento de
conversión del sustrato
• No requiere grandes
extensiones de terreno
• Fácil manejo
Biocatalizadores
• Uso de biocatalizadores para llevar a cabo
biotransformaciones, el catalizador (célula o
enzima) en un sistema continuo dará como
resultado:
Disminución en los costos del proceso
Mayor pureza del producto,
Mayor productividad, etc.
• También se puede pensar en la reutilización del
biocatalizador en procesos batch. Para lograr el
objetivo los biocatalizadores se inmovilizan.
Enzimas
α-AMILASA
• Son producidas por bacterias y hongos y pueden ser clasificadas por
su actividad: licuefacción o sacarificación.

Microorganismos

• Bacillus es la fuente de mayor importancia comercial

 B. amyloliquefaciens: primera en aparecer en el mercado
• B. licheniformis: más empleada por su alta termoestabilidad.
Aplicaciones

• Industria panadera: Aceleran la

degradación del almidón, y así aumenta el
contenido de azúcar en la masa, acelerando
el proceso de fermentación. El volumen del
pan preparado con enzimas aumenta.
• Industria alimentaria: fabricación de
jarabes y glucosa.
• Industria textil: Desengomado, las amilasas
eliminan la goma protectora basada en
almidón, para hacer la mezclilla elástica,
son enzimas resistentes a altas
temperaturas para acelerar el proceso.
PECTINASAS
• Denominan a un complejo de enzimas que se clasifican de
acuerdo con el sustrato (pectina o ác. Péctico), del tipo de reacción
(hidrólisis o transeliminación) y del mecanismo, incluyendo
además a la pectinesterasa. Los productos comerciales provienen
generalmente de Asperigillus niger.

• Aplicaciones
• Industria alimentaria: principalmente en la extracción,
clarificación de jugos, vinos y cervezas y para desengomar fibras.
• Al prensar fruta y vegetales para la obtención de jugo, las pectinas
de alto peso molecular reducen la producción.
GLUCOSA ISOMERASA
• Cataliza la isomerización de
glucosa en fructosa. Se produce
industrialmente gracias a
diversos microorganismos,
como Bacillus
coagulans, Streptomyces phaech
romogenes, S. olivaceus, S.
olivochromogenes.

Aplicación
• Se emplea en la producción de
jarabes de fructosa a partir de
jarabes de glucosa.
DEXTRANSACARASA

• Las glucansacarasas son un grupo de

enzimas, sintetizadas por la familia
Lactobacíllaceae, que catalizan la
síntesis de glucanos con diferentes
estructuras a partir de sacarosa. Los
glucanos que tienen la cadena
principal constituida por uniones α(1-
6) entre glucosas se conocen como
dextranos, y las enzimas que los
sintetizan se llaman dextransacarasas
.
• dextransacarasas son inducibles, extracelulares, producidas
por bacterias de los géneros Strepiococcus, Leuconostoc y
Lactobacillu.s. De las tres especies del género Leuconostoc (L.
mesenteroides, L. dextranicium y L. citrovorum).

Aplicaciones

• Se emplean principalmente en la industria azucarera para

tratar la contaminación por dextranas producida
por Leuconostoc mesenteroides en el jugo de caña de azúcar.

• Son utilizadas como sustitutos de plasma en transfusiones

sanguíneas (dextrana clínica)
PROTEASA
• Una proteasa es una enzima que ayuda a degradar las
proteínas.
• Usa como sustrato almidón de papa, pasta de soya, malta
carbonato de calcio.

Bacterias: Bacillus
Entre los principales hongos productores:
Mucor pusillus, Mucor miehei, Mucor pusillus Lindt,
especies de cepas mutantes de Penicillium, Mucor
circinelloides f. circinelloides, Mucor subtilissimus, Mucor
variosporus, Mucor carbonaceus, Aspergillus spp. y
Rhizopus spp.
Aplicaciones
• Industria de la panadería: Mejora la calidad
del pan. Disminuye la viscosidad de la
pasta. Mejora la coloración de la superficie.
• Industria alimentaria: fabricación de
bebidas, ablandadores de carne, fabricación
de productos fermentados de soya y de
pescado, saborizantes, elaboración de
quesos, concentrados proteicos y
producción de hidrolizados proteicos
• Se usan en los detergentes para lavar la
ropa
• Curtileria, Eliminar pelos de la piel de los
animales
CELULASAS
• Las celulasas son enzimas pertenecientes al grupo de las
glicosil hidrolasas, producidas por hongos y bacterias,
así como también algunos animales.

• El proceso de degradación de la celulosa parece ser

diferente para distintas especies, especialmente entre
microorganismos aeróbicos y anaeróbicos.
 Microorganismos Aeróbicos
Trichoderma reesei
Secreta una combinación de
endoglucanasas y celobiohidrolasas, las
cuales atacan su sustrato individualmente
pero sinergísticamente.
Microorganismos Anaeróbicos
Clostridium cellulovorans
Clostridium cellulolyticum
Clostridium Josui
Clostridium thermocellum
Producen complejos multienzimáticos
extracelulares que tienen alta actividad
degradando celulosa cristalina
Aplicaciones
• Alimenticia: disminuye la viscosidad y se mantiene la textura en los jugos de
frutas. Además liberan antioxidantes de la fruta, lo que ayuda a controlar
enfermedades coronarias.
• De cervecería: en donde las celulasas del tipo endoglucanasa son utilizadas
para la hidrólisis del enlace 1,4-β- glucosídicos de las semillas de cebada, lo
que reduce la viscosidad y libera azúcares reducidos durante la primera
fermentación.
• De Vino: celulasas del tipo β-glucosidasa son utilizadas para el
mejoramiento del aroma del vino. Así mismo el uso de endoglucanasas es
conocido para el mejoramiento en las eficiencias de las etapas de
maceración, clarificación y filtración, así como también para a la obtención
de un vino de mejor calidad y estabilidad.
• Textil: las aplicaciones más relevantes en esta área son en la destinción de
prendas para dar apariencia de gastado, tratamiento de las telas para
eliminar imperfecciones de las fibras,
EXTREMOENZIMAS

• se producen en microorganismos adaptados a

situaciones extremas.
Los microorganismos poseedores de estos enzimas
reciben el nombre de extremófilos, debido al hecho que
viven en condiciones que resultan letales para otros
microorganismos.
Los microorganismos extremófilos pertenecen al
dominio Archaea
 Fenotipo Medio ambiente Microorganismos Enzimas que
producen

Termófilas 45-85°C Methanobacterium, Thermoplasma, Thermus*, Amilasas, proteasa,

algunas especies de bacillus polimerasa

Hipertermofilas 80-113°C Aquifex*, Archaeoglobus, Hydrogenobacter*, Amilasas, proteasa,

Methanothermus, Pyrococcus, Pyrodictium, polimerasa
Extremófilos y su medio ambiente Pyrolobus,
Sulfolobus, Thermococcus, Thermoproteus,
Thermotoga*

Psicrofilas -2-20 °C Alteromonas*, Psychrobacter* Amilasas, proteasa,

deshidrogenasa

Acidófilas pH<4 Acidianus, Desulfurolobus, Sulfolobus,

Thiobacillus*

Alcalósilas pH>9 atronobacterium, atronococcus, algunas

especies de bacillus*

Halófilas 2-5 M NaCl Haloarcula, Halobacterium, Haloferax,

Halorubrum

Piezófilas alta presión

Metalófilas alta concentración de

metales

Radiófilas altos niveles de radiación

Microaerófilas bajo nivel de oxígeno

Aplicaciones
• Industrias azucarera, textil y papelera: Se utilizan en la obtención
de jarabes de glucosa, fructosa, recubrimiento amiláceo de
determinados alimentos, industria panadera, de bebidas, etc.
Algunos ejemplos pueden ser: α-amilasa de Pyrococcus woesei,
Pululanasa de Pyrococcus woesei, β-glucosidas.
•
• Industria de detergentes: Los organismos hipertermófilos
sintetizan un abundante número de proteasas y peptidasas intra y
extracelulares con una gran variedad de sustrato-especificidades.
Las proteasas procedentes de los géneros Desulfurococcus,
Thermococcus y Pyrococcus son algunos ejemplos.
•
• Industria farmacéutica: Las extremoenzimas pueden utilizarse con
fines analíticos, como es el caso, por ejemplo, de la determinación
de glucosa en sangre. La enzima usada en esta determinación es la
glucosa DSH de Sulfolobus solfataricus.
CÉLULAS INMOVILIZADAS
 Células inmovilizadas.
• El termino inmovilización de células y enzimas, se
refiere a células y enzimas físicamente confinadas o
localizadas en una cierta región definida en el
espacio reteniendo sus propiedades y actividades
catalíticas.
• Dependiendo del tipo de inmovilización, tanto las
células, como las enzimas pueden ser inmovilizadas
de forma permanente o temporal para ser utilizadas
repetida y continuamente en diversos procesos
químicos.
•
• Por razones técnicas y económicas la mayoría de
los procesos químicos catalizados por enzimas o
llevados a cabo por células requieren su
reutilización o el continuo uso de
biocatalizadores durante largos periodos de
tiempo.
• Bajo esta perspectiva, la inmovilización debería
ser definida como una técnica capaz de reutilizar
o dar uso continuo de biocatalizadores y células.
 La inmovilización.

La inmovilización combina la actividad elevada y

especifica de las biomoléculas activas, como las
enzimas o anticuerpos, con la estabilidad química
y mecánica del soporte.
Consiste en mantener la biomolécula unida o
atrapada en un soporte físico, conservando su
actividad catalítica y permitiendo el flujo de
sustratos y productos.
Para obtener biocatalizadores inmovilizados que
retengan actividad y sean estables es necesario
aplicar un método de inmovilización adecuado,
que dependerá del tipo de actividad catalítica de
interés. Existen diversos métodos para inmovilizar
células
 Métodos de inmovilización:
Métodos de Inmovilización Irreversibles:

• Formación de enlaces covalentes.

• Formación de enlaces cruzados.
• Atrapamiento.
• Atrapamiento por micro-encapsulación.
Métodos de Inmovilización Irreversibles.

• El concepto de inmovilización irreversible

implica el enlace del biocatalizador a un soporte
de manera permanente, por lo cual el
biocatalizador no puede ser liberado sin destruir
o modificar su actividad biológica o el soporte.
a) Formación de enlaces covalentes.

• La inmovilización de proteínas por métodos

basados en la formación de enlaces covalentes
están entre los más usados. La ventaja de estos
métodos estriba en la naturaleza estable de los
enlaces formados entre las enzimas y el soporte.
De igual manera, las enzimas en este método no
son liberadas en la solución en uso.
• Los métodos covalentes de inmovilización son
empleados cuando existe un requerimiento
estricto de ausencia de enzimas en el producto.

• En este método se enlaza covalentemente la

enzima con un soporte insoluble natural o
sintético.
• El enlace se da entre algún grupo funcional
reactivo de la enzima (amino, Cis-tiol, Tir-
hidroxil o His-imidazol) y el soporte
previamente activado, generalmente recubierto
con grupos funcionales orgánicos en la
superficie (Monocapas tiol autoensambladas,
oro, etc.)
 Figura 1. Enzimas inmovilizadas en un
soporte físico por enlace covalente, las
enzimas se encuentran orientadas
espacialmente en el soporte

El seguimiento de la inmovilización se realiza cuantificando la

concentración de proteína libre (generalmente por el método de
Bradford), y de la proteína unida covalentemente al soporte.
Desventajas.
Una desventaja de este método radican en el sitio
del enlace, ya que puede modificarse el sitio activo
o pueden ocurrir impedimentos estéricos que
reduzcan la actividad. Sin embargo, esto es poco
probable y puede verse reducido al dirigir el
enlace a sitios específicos y/o con una orientación
molecular definida.
 b)Formación de enlaces cruzados.

En esta técnica los soportes no son necesarios, ya que

la inmovilización se da por un enlace directo entre
enzimas, que puede ser mediado o no por un agente
de unión.
Generalmente se añade el agente de bajo peso
molecular (ej. glutaraldehído) a la enzima en solución,
uniendo covalentemente los grupos funcionales de las
enzimas para formar agregados. Este método tiene
como ventaja su sencillez, sin embargo, es susceptible
a cambios pequeños de pH y temperatura en las
condiciones de operación .
Enzimas inmovilizadas por enlaces
cruzados (líneas negras).
 c) Atrapamiento.

• El método de atrapamiento está basado en la

colocación de las enzimas dentro de una red
polimérica que permite al sustrato y a los productos
pasar a través de ellos y retener las enzimas.
• Este método difiere de los métodos de acoplamiento
covalente descritos anteriormente, ya que las
enzimas no están enlazadas a la matriz o soporte.
Existen diversos métodos de atrapamiento de
enzimas como el de gel y por inclusión.
Inclusión en Gel Húmedo.
• La enzima queda atrapada dentro de una matriz de
gel que permite una fácil difusión de productos.
• La matriz puede ser de origen natural o sintético y
de diversos materiales (Sílica gel, poliacrilamida,
agarosa, carregnatos, entre otros), y pueden
clasificarse como geles húmedos, geles secos
(xerogeles) o geles en aerosol (aerogeles). En este
método las enzimas son colocadas en una solución
que posteriormente es gelificada (por temperatura o
adición de polimerizantes), quedando atrapadas
dentro de la matriz (Figura 3A).
Inclusión en Gel seco y triturado.
• En algunos casos el gel es sometido a un proceso
de secado y molido, obteniendo así mayor área
de contacto entre la enzima y la solución que
contiene el sustrato (Figura 3B), dando como
resultado esferas con un tamaño de poro de 35
± 7 Å.
Figura 3. Enzimas inmovilizadas por inclusión
dentro de una matriz de gel.
A) gel húmedo. B) esferas del gel seco y triturado.
 d)Atrapamiento por micro-
encapsulación.
• El método puede ser de dos tipos: por
microencapsulación en soportes porosos (con un
diámetro de 2-50 nm), que posteriormente pueden
ser recubiertos con un revestimiento
nanocompuesto, atrapan la enzima en su interior y
permiten el paso de sustratos y productos (Figura
4A); por microemulsión o liposomas, combinando la
enzima con agentes emulsificantes y agitando para
formar micelas que la protegen de medios
ácidos/alcalinos, proteasas y durante los periodos de
almacenamiento.
Ventajas:
• Es muy sencilla, suficientemente porosa para
permitir que la enzima funcione en un sistema
en solución, pero al mismo tiempo protegida del
ambiente degradante.
• Puede llevarse a cabo repetidas veces (emulsión
múltiple), agregando agentes emulsificantes
secundarios y espesantes (ej. goma arábiga,
Tween 80, entre otros), para proporcionar una
mayor protección de la enzima.
Figura 4. Enzimas inmovilizadas por
encapsulación.
A) microencapsulación dentro de esferas
porosas.
B)Soporte esférico poroso.
 Métodos de Inmovilización
Reversibles:

• Por adsorción.
• Adsorción no específica.
• Adsorción hidrofóbica.
• Quelación o enlace metálico.
• Formación de enlaces disulfuro.
• Puntos críticos.
• En el método de inmovilización reversible, las
enzimas inmovilizadas pueden ser desprendidas
del soporte bajo condiciones no extremas.
• El uso de métodos reversibles para la
inmovilización de enzimas es altamente
atractivo, principalmente por razones
económicas debido a que el soporte puede
regenerarse y recargarse con enzimas nuevas
cuando la actividad enzimática decae.
 a)Por adsorción.
• El método de adsorción
emplea soportes orgánicos o
inorgánicos que presentan un
adsorbente activo en los
cuales, las enzimas son
atraídas y retenidas por medio
de interacciones iónicas o
fuerzas débiles (puentes de
hidrógeno, fuerzas de Van der
Waals, interacciones
hidrofóbicas).
• Este método consiste en poner en contacto la
enzima en solución acuosa con un soporte
adsorbente por un lapso de tiempo dado (2-48
h), para después lavar el soporte y eliminar la
enzima que no fue inmovilizada.
 Figura 5. Enzimas inmovilizadas en un
soporte físico. A) Por adsorción, la región
positiva de la proteína interactúa
con el soporte negativo.
 Pros y contras:
• Mantiene intacta la actividad de la enzima, ya
que la unión es débil y no afecta su
conformación.
• Esta característica hace que al mismo tiempo la
unión sea reversible y sensible a cambios de pH
y temperatura.
 b)Adsorción no específica.
• Este método es uno de los más sencillos, el cual se basa en la
adsorción física o enlace.

• En la adsorción física las enzimas son unidas a la matriz a

través de puentes de hidrógeno, fuerzas de van der Waals, o
interacciones hidrofóbicas; mientras que enlaces iónicos de
enzimas son producidos a través de uniones con sales.

• La naturaleza de las fuerzas involucradas en la inmovilización

no covalente resulta en un proceso que puede ser reversible
cambiando las condiciones que influyen en la resistencia de la
interacción (ej. pH, resistencia iónica, temperatura y
polaridad del solvente).
 c)Adsorción hidrofóbica.
• Otro método es el uso de interacciones hidrofóbicas,
donde la adsorción hidrofóbica ha sido utilizada
como un principio cromatográfico por más de 3
décadas.
• Consiste en variables experimentales conocidas
como el pH, concentración de sales, y la
temperatura. La resistencia de las interacciones
radica en la hidrofobicidad del adsorbedor y de la
proteína.
• La hidrofobicidad del adsorbedor puede ser
regulada por el grado de sustitución del soporte y
por el tamaño de la molécula ligante hidrofóbica.
d) Quelación o enlace metálico.
• Este método consiste en sales de metales de transición o hidróxidos
depositados en la superficie de soportes orgánicos enlazados a
grupos nucleofílicos en la matriz.

• Se utilizan principalmente sales de titanio y circonio, siendo este

método conocido como inmovilización por enlace metálico.

• La sal metálica o el hidróxido es precipitado en el soporte (ej.

celulosa, quitina, acido algínico y bases de sílice) por calentamiento
o neutralización.

• Debido a los factores estéricos es posible para la matriz ocupar todas

las posiciones de coordinación del metal, y por lo tanto algunas de
las posiciones permanecen libres para coordinarse con grupos de
enzimas.
e) Formación de enlaces disulfuro.

• Estos métodos son únicos, porque aunque se forma

un enlace covalente estable entre la matriz y la
enzima, es posible que se rompan los enlaces por
medio de una reacción utilizando agentes
apropiados como el dithiotreitol (DTT) bajo suaves
condiciones.
• Además, debido a que la reactividad de los grupos
tiol pueden ser modulados mediante la alteración
del pH, la actividad es alta para métodos que usan
enlaces disulfuro, con la condición de que el
apropiado tiol adsorbente con alta especificad.
 f)Puntos críticos.
• Cuando se estabiliza una enzima por
inmovilización, un cambio estructural
irreversible puede ser prevenido restringiendo el
movimiento de los segmentos al encerrar la
enzima en cavidades estrechas.
• Un tamaño de poro similar al tamaño de la
enzima es más apropiado para obtener una
buena actividad.
• Un alto rendimiento en la estabilización puede
ser logrado al añadir azúcares a la enzima en
solución, ya que estos pueden contribuir a
mantener la estructura tridimensional de la
proteína, lo que es crucial para su actividad,
además, el tipo y la cantidad de azúcar utilizado
en la estabilización es determinante para
generar una alta actividad catalítica.
Para llevar a cabo la inmovilización de
enzimas y células es necesaria la
selección de soportes.
• Las características de las matrices o soportes son de gran
importancia en la determinación de la eficiencia del sistema de
inmovilización de enzimas.

• Las propiedades ideales de un soporte incluyen:

• 1) la resistencia física a la compresión.
• 2) hidrofilicidad.
• 3) que sean inertes entre las enzimas y sus derivados.
• 4) biocompatibilidad.
• 5) resistencia al ataque microbiano y químico.
• 6) bajo costo.
• 7) insoluble.
• 8) alta rigidez.
TIPOS DE SOPORTES
• Carriers Inorgánicos

• - Naturales: arena, silicatos, arcillas. - Sintéticos:

vidrios de porosidad controlada, cerámicas.

• Carriers Orgánicos
• - Naturales: virutas de madera, antracita, colágeno,
celulosa, alginatos, carragenatos, albúmina.
• - Sintéticos: PVC, polipropileno, poliacrilamida,
resinas de intercambio iónico, epóxidos,
poliuretanos.
Más aplicaciones

• Aplicaciones médicas.

• Existen muchas enfermedades causadas por una

alteración o carencia de una determinada enzima.
También hay enzimas con actividad antitumoral,
cicatrizante y con otras acciones terapéuticas. El
tratamiento con estas enzimas inmovilizadas
permitiría una acción más prolongada, ya que serían
más resistentes a la acción de las proteasas. Por
ejemplo, la L-asparaginasa se utiliza en el
tratamiento de leucemias y cánceres diseminados
que requieren asparragina para desarrollarse.
• En la actualidad se ha diseñado un
hemodializador de fibra hueca que contiene
asparaginasa inmovilizada. La tripsina o la
colagenasa se utilizan para eliminar los tejidos
muertos de heridas, quemaduras, úlceras, etc.;
para acelerar el crecimiento de nuevos tejidos e
injertos de piel, y también para inhibir el
crecimiento de algunos microorganismos
contaminantes.

• Este tipo de enzimas se pueden inmovilizar en

celulosas o fibras que formarán parte del tejido
de apósitos y vendas.
• Aplicaciones en la Industria Farmacéutica.

• La Industria Farmacéutica trabaja con moléculas

lábiles, y en muchos casos con moléculas quirales.

• El empleo de enzimas inmovilizadas es una

alternativa seria a la síntesis química en pasos clave,
donde no conviene trabajar a temperaturas altas o
se requiere una elevada especificidad de sustrato.

• Los enzimas son unos reactivos quirales estrictos,

es decir, biocatalizadores con una estructura
tridimensional asimétrica definida que permiten la
obtención de productos de gran pureza óptica
• . Se trata de una ventaja fundamental cuando las
reglamentaciones exigen la síntesis de
compuestos ópticamente puros, ya sean
fármacos, hormonas o antibióticos.
Conclusiones.
• La inmovilización de células y enzimas es un proceso
prometedor en la industria, con las ventajas y desventajas
antes mencionadas, y bajo condiciones que pueden ser
optimizadas en el laboratorio, pero sobre todo con un enorme
campo de aplicación.

• Este proceso puede ayudar a mejorar la producción de

alimentos, fármacos, químicos y bioproductos de interés
científico y económico

• Cabe mencionar que aunque la inmovilización sea dirigida a

un sitio y/o por un método específico, los enlaces químicos y
las interacciones entre la enzima y el soporte son complejos, y
un método de estabilización único no asegura que las
interacciones sean 100% propias del método.
Bibliografía consultada:
• INMOVILIZACIÓN DE CÉLULAS Y ENZIMAS Artículo: Raúl Fajardo-
Ochoa1, Juan Alberto Osuna-Castro1, Carlos VillaVelázquez-Mendoza2,
Pilar Escalante-Minakata2 y Vrani Ibarra-Junquera3*
• Taylor, R.F. (1991) Protein Immobilization: fundamentals and
applications, Marcel Dekker, New York.
• Hartmeier, W. (1985) Immobilized biocatalysts: from simple to complex
systems. Trends Biotechnol. 3: 149-153.
• Martinek, K.; Mozhaev, V.V. (1987) Immobilization of enzymes: an
approach to fundamental studies in biochemistry. Adv. Enzymol. 57: 179-
249.
• http://www.revista.unam.mx/vol.15/num12/art96/#