COLORACION GIEMSA

FUNDAMENTO
La tinción de Giemsa es un método habitual para el examen de
frotis sanguíneos,cortes histológicos y otro tipo de muestras
biológicas. Este método tiene utilidad sobre todo para poner de
manifiesto las rickettsias localizadas dentro de las células
huéspedes. La coloración de giemsa se emplea también para teñir
frotis de sangre en el examen para protozoos

Estos poliorganismos adquieren una coloración diferencial y se ven

dentro del citoplasma de la célula huésped. La técnica de Giemsa
está formada por varios colorantes: los tintes neutros utilizados
combinan el azul de metileno como tinte básico y la eosina como
tinte ácido, lo que da una amplia gama de colores. El azul de
metileno es un colorante metacromático, de ahí que muchas
estructuras se tiñan de púrpura y no de azul. El pH de la solución
de coloración es crítico y se debe ajustar idealmente según diversos
fijadores. La gama del pH debe estar entre 6.4 y 6.9.
REACTIVO: GIEMSA

PROCEDIMIENTO:

Desparafinar e hidratar.
Aplicar solución de trabajo de Giemsa durante 10
minutos.

Deshidratar con alcohol absoluto, 3 cambios. 1

Aclarar con xilol, 3cambios.

RESULTADOS:
 Citoplasma: Rosa
 Núcleos: Azul
 Eritrocitos: Rosa - Naranja
 Gránulos De Las Células Cebadas: Púrpura
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 Bacterias: Azul
COLORACIÓN DE GRAM
 COLORACION DE GRAM

FUNDAMENTO

De gran importancia en Microbiología porque permite diferenciar dos grandes grupos de

bacterias (Gram+ y Gram-), según se comporten ante esta tinción. El fundamento radica
en la diferente estructura de la pared celular de ambos grupos: las bacterias Gram+ tienen
una gruesa capa de peptidoglicano en su pared, mientras que las bacterias Gram- tienen
una capa de peptidoglicano más fina y una capa lipopolisacarídica externa. Tras la tinción
con el primer colorante (Cristal violeta) se efectúa un lavado con etanol que arrastrará al
colorante sólo en las Gram (-), mientras que en las Gram (+) el colorante queda retenido y
las células permanecerán azules. Las células Gram (-) se teñirán después con un colorante
de contraste (safranina) para que puedan observarse.
 OBJETIVOS

• Utilización de técnicas sencillas para la observación de microorganismos

• Conocer o manejo del microscopio óptico para la observación de bacterias (importancia
del objetivo de inmersión)
• Conocer y manejar las unidades de medida de las células y establecer
comparaciones entre tamaños de procariotas y de eucariotas

• Reconocer los distintos modelos de pared bacteriana.

 MATERIALES

 Mechero Bunsen o de Alcohol

 Asa de Siembra o aguja enmangada
 Pinzas
 Portaobjetos
 Muestras bacterianas de origen natural: Yogur, Sarro Dental, Suelo, etc.
 Palillos
 Microscopios
 Aceite de inmersión
 Soporte de Tinciones
 Goteros
 Pinzas
 Agua destilada
 Colorantes para Tinción: Solución de cristal Violeta Lugol Safranina Etanol 95%
 PROCEDIMIENTO

PASOS PARA LAS MUESTRAS :

1. En unas gotas de agua colocadas sobre un portaobjetos, disuelve una pequeña cantidad
de yogur con ayuda de un palillo higiénico. Haz lo mismo con la muestra de sarro dental
extraído de la boca de alguien.2. Prepara una fina extensión (frotis), en otros portas,
dejándolos secar.3. Fija este frotis dándole varios pases a los portas sobre la llama del
mechero, con la muestra hacia arriba.

TINCIÓN:

1. Cubre ambos frotis con cristal violeta durante 3 min. Se retirará el colorante
mediante un suave lavado con agua, deslizando el agua sobre el porta, para non
desprender la muestra. Se 2. cubrir ahora con Lugol durante 1 min., y después se
realizará otro lavado suave. Todas las células se teñirán de violeta.

2. Se retirará el colorante con etanol, goteándolo por el portaobjetos, hasta que las gotas
que salen no tengan casi color. Las células Gram- pierden el colorante violeta y
quedarán incoloras. Las Gram + seguirían violeta.
3. Añade una gota de agua a la preparación y cubre las preparaciones 2 min. con
safranina (colorante de contraste). Finalmente, lava el colorante con agua. Este
colorante sólo entrará en las bacterias Gram –, que quedarán rojas y las Gram +
seguirán violetas.

Seca las preparaciones sobre papel de filtro y obsérvalas con microscopio utilizando el
objetivo de inmersión (Observar (100×) Lugol). En esta tinción diferencial las bacterias
Gram – aparecen ROJAS y las Gram +VIOLETA.

Tinción negativa

1. Colocar una pequeña gota de tinta china en el extremo de un portaobjeto, colocar una
gota de muestra.
2. 2. Realizar frotis.
3. 3. Dejar secar.
RESULTADO:

Gram –: ROJAS
Gram +:VIOLETA.

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COLORACION DE GROCOTT
 COLORACION DE GROCOTT

La plata metanamina de Grocott es un método de tinción especial más empleado para

hongos. La reacción tintorial está basada en que, en presencia de ácido peryódico, los
polisacáridos de la pared celular de los hongos son oxidados a aldehídos; éstos, a su
vez, reducen el complejo nitrato-plata metanamina produciendo una coloración de café a
negra, debido al depósito de plata reducida en los lugares de localización de los
aldehídos.

También se utiliza para la identificación de la melanina.

OBJETIVO:
Demostrar Hongos.

FIJADOR:
Formol al 10%
 REACTIVOS PROCEDIMIENTO
Solución de ácido bórico (solución A): Debe evitarse, durante todo el proceso, el uso de
3,09 g de ácido bórico. instrumentos metálicos, ya que la plata
250 cc de agua destilada precipitaría sobre ellos.

Solución de tetraborato sódico Desparafinar e hidratar.

(solución B): Añadir ácido peryódico 0,5%, 12 minutos.
4,77 g de tetraborato sódico. Lavar con agua destilada.
250 cc de agua destilada. Sumergir los cortes en la solución de plata
metanamina, 1 hora mínimo a 60 ºC; a partir de
Solución buffer borato (comprobar que este tiempo comprobar regularmente al
el pH sea 8.2) microscopio.
13cc de solución A. Lavar con agua destilada.
7 cc de solución B. Añadir cloruro de oro 1minuto.
Lavar con agua destilada.
Solución de plata metanamina  Añadir tiosulfato sódico 3%, 1-2minutos.
42,5 cc de metanamina Lavar con agua corriente.
(hexametilentetranamina) 3%. Tinción de contraste (rojo
2,5 cc de nitrato de plata 5%. nuclear, hematoxilina, verde luz...), 1minuto.
12 cc de buffer borato (pH 8.2). Deshidratar, aclarar, montar.
 RESULTADOS

 Reticulina, Membranas Basales, Hongos, Mucinas, Glucógeno: Negro.

 Fondo: Según Tinción De Contraste.
 Nucleos: Marrón Oscuro A Negro
COLORACION DE FITE-FARACO
 TÉCNICA DE FITE FARACO.
OBJETIVO:
Demostración de BAAR. PROCEDIMIENTO:

FIJADOR:  Xilol-Aceite de Oliva a 60*C 30min.

Formol al 10%.  Lavar en Agua Jabonosa.
REACTIVOS:  Lavar en Agua.
 Carbol-Fucsina…20min.
 Agua 50ml.  Lavar en Agua.
 Fenol (fundido, a baño maría) 2.5ml.  Decolorar con Acido Sulfúrico (por
 Alcohol ABS 5ml. goteo).
 Fucsia Acida0.5gr.  Lavar en Agua.
 Acido Sulfúrico al 5%  Verde Brillante 1min.
 Acido Sulfúrico 5ml.  Secar al Aire.
 Agua…95ml.  Aclarar y Montar.
 Verde Brillante al 1%
 Verde Brillante 1gr.
 Agua 100ml.
 Solución Xilol-Aceite de Oliva
 Xilol 50ml.
 Aceite de Oliva 50ml.
RESULTADOS:

BAAR: Rojo Brillante.

Resto del Tejido: Verde.

COLORACION DE P.A.S
 FUNDAMENTO

La tinción de PAS (Periodic Acid-Schiff ) es una de las tinciones más comúnmente

utilizada en histología y se utiliza para evidenciar la presencia de grupos aldehídos
formados por oxidación previa de los hidratos de
carbono.

El fundamento de la reacción consiste en oxidar los tejidos mediante el ácido peryodico

para incrementar el número de grupos carbonilos (aldehídos o cetonas) presentes en
ellos. Posteriormente, se trata la muestra con el reactivo de Schiff que reacciona con dos
grupos aldehídicos contiguos dando lugar a una coloración rojo-púrpura característica.

El Kit de PAS se compone de todos los reactivos que intervienen en esta tinción.
REACTIVOS
Solución de Acido Peryodico al 5%.
Acido Peryodico… 0.5gr.
Agua… 100ml.
 Solución deAcido Clorhídrico 1N.
Acido Clorhídrico…83.5ml.
Agua…916.5ml.
Reactivo de Schiff de Coleman.
Fucsina Básica…1gr.
Agua-Caliente a 60C…200ml.
 Llevarlo a Punto de Ebullición.
Dejarlo enfriar y luego agregar
Metabisulfito de Potasio…2gr.
Acido Clorhídrico 1N…10ml.
Dejarlo aclarar durante 24Hrs y luego
agregar: Carbón Activado…0.5gr.
REACTIVOS DEL KIT
 Kit de PAS DC (*)
 Xileno mezcla de isómeros DC (*)
 Etabol 96% DC (*)
 Etanol Absoluto DC (*)
 Eukitt ®,medio de montaje DC
Componentes del Kit
 Reactivo A Ácido peryódico
Reactivo B Reactivo de Schiff
Reactivo C Potasio meta-Bisulfito solución
Reactivo D Solución fijadora
Reactivo E Hematoxilina de Mayer
PROCEDIMIENTO:

 Desparafinar é hidratar.
 Acido Peryodico 5min.
 Lavar en Agua.
 Reactivo de Schiff 40min.
 Lavar en Agua Caliente 10min.
 Hematoxilina 3-8min.
 Lavar en Agua.
 Deshidratar, Aclarar yMontar.
PROCEDIMIENTO 2

1.Una vez los cortes hayan sido desparafinados y rehidratados, enjuagar con agua destilada
2. Depositar sobre el corte 10 gotas de Reactivo A. Dejar reaccionar durante 10 minutos.
3. Lavar con agua destilada.
4. Depositar sobre el corte 10 gotas de Reactivo B. Dejar reaccionar durante 20 minutos.
5. Lavar con agua destilada.
6. Depositar sobre el corte 10 gotas de Reactivo C. Dejar reaccionar durante 2 minutos.
7. Escurrir el portaobjetos.
8. Sin lavar, depositar sobre el corte 10 gotas de Reactivo D. Dejar reaccionar durante 2
minutos.
9. Lavar con agua destilada.
10.Depositar sobre el corte 10 gotas de Reactivo E. Dejar reaccionar durante 3 minutos.
11.Hacer virar en agua corriente durante 5 minutos.
12.Deshidratar utilizando la serie creciente de alcoholes.
13.Aclarar con Xileno.
14.Montar con medio de montaje.
15.Observar al microscopio.
RESULTADOS:

Núcleo :VIOLETA-NEGRO

Polisacáridos Simples (Glucógeno), Mucopolisacáridos Neutros,

Mucoproteínas, Membrana Basal, Glucolípidos : ROJO-PÚRPURA

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COLORACIÓN DE ZIEHL-NEELSEN
 COLORACIÓN DE ZIEHL-NEELSEN

La tinción de Ziehl-Neelsen (BAAR) es una técnica de tinción diferencial rápida y económica,

usada para la identificación de microorganismos patógenos, como M. tuberculosis o el género
Apicomplexa (coccidios intestinales) entre otros.
Fue descrita por primera vez por dos médicos alemanes: Franz Ziehl, un bacteriólogo, y
Friedrich Neelsen, un patólogo.

FUNDAMENTO

Las paredes celulares de ciertas bacterias contienen ácidos grasos que les confieren la
propiedad de resistir la decoloración con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes
básicos.

Las micobacterias como Mycobacterium tuberculosis y M. marinum se caracterizan por sus

propiedades de ácido-alcohol resistencia. La coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere
calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. Al
suspender el calentamiento y enfriar con agua, provoca una nueva solidificación de lo ácidos
grasos de modo que el colorante ya no puede salir de las bacterias. Las bacterias que resisten la
decoloración son de color rojo y las que no, se ven de color azul ya que se utiliza azul de
metileno como tinción de contraste.
 TÉCNICA
PROCEDIMIENTO

Los reactivos necesarios para su El procedimiento es el siguiente:

realización son los siguientes:
ácido periódico 58% carbol fucsina de desparafinar e hidratar los cortes
Ziehl culina (fucsina fenicada). Preparar ácido periódico 5%, 10 min
mezclando en el orden dado:  lavar con agua destilada
fucsina fenicada, 15 min
decolorar en alcohol ácido al 50%
0,5 g fucsina básica
lavar con agua destilada
50 cc agua destilada
hematoxilina, 10 min
5 cc etanol absoluto azulidificar con, por ejemplo, carbonato
28,5 g cristales de fenol derretidos de litio
hematoxilina deshidratar, aclarar y montar
alcohol ácido 1%: preparaciones
alcohol de 35º
ácido clorhídrico
 VARIANTE CLÁSICA O "EN CALIENTE“

Éstas variantes son para preparaciones citológicas.

 Hacer un frotis de la muestra.

La fijación al calor asegurará de que el frotis quede adherido al portaobjetos. Un frotis
muy delgado puede darle resultados falsamente negativos y un frotis muy grueso
puede desprenderse del portaobjetos durante la tinción.
Utilizando pinzas, coloque los portaobjetos en una gradilla de tinción con los
extendidos hacia arriba. Nunca tiña más de 12 portaobjetos a la vez.
 Dejar el frotis sobre el puente de tinción.
 Aplicar fucsina-fenicada.
Deje que el colorante permanezca sobre los portaobjetos durante 5 minutos. Mantenga
el calor durante este período.
 Calentar con un mechero hasta la emisión de vapores (3-5 minutos).
Se requiere el tiempo adecuado para que la fucsina fenicada penetre y tiña la pared
celular de la bacteria. No deje que hierva o se seque el colorante.
Lave suavemente el colorante de cada portaobjetos con agua corriente fría hasta que
toda la tinción libre quede lavada. Lave suavemente de manera que el extendido no se
barra del portaobjetos. Retire el exceso de agua.
 Decolorar con alcohol-ácido.
Cubra cada portaobjetos con la solución decolorante, tal como alcohol ácido y
manténgalo sobre el portaobjetos durante 7 minutos. Si no se decolora
suficientemente, el contenido del esputo que no son bacilos TBC puede permanecer
teñido. Enjuague con agua una vez más los portaobjetos y quite el exceso de agua. Si
los portaobjetos aún están rosa, aplique una cantidad adicional de la solución
decolorante de 1 a 3 minutos.
 Aplicar azul de metileno (1 minuto).
 Enjuagar con agua
 Observación
 EN "FRÍO" (TINCIÓN DE KINYOUN)

Hacer un frotis.
Dejarlo en el puente de tinción.
Aplicar fucsina-fenicada (solución con fenol y
mayor concentración de fucsina).

Dejar en vasos coplin durante 20 minutos.

Decolorar con alcohol ácido.
Lavar con agua del grifo. RESULTADOS
Contrastar con azul de metileno