FUNDAMENTOS DE INGENIERIA

BIQUIMICA

U2
EFECTO DE LA INMOVILIZACION
DE ENZIMAS
 Inmovilización enzimática
Enzimas catalizan reacciones biológicas en nuestro cuerpo, pero también se
pueden usar para catalizar reacciones industriales fuera del cuerpo. Estas
enzimas son a menudo unidos a un soporte ('inmovilizado') y se puede
utilizar para una amplia gama de propósitos.
 Etapas en el desarrollo de enzimas
inmovilizadas
.
 ASPECTOS GENERALES SOBRE LA
INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS

 La inmovilización de enzimas es un proceso en el que

se confina o localiza a la enzima en una región
definida del espacio, para dar lugar a formas
insolubles que retienen su actividad catalítica y que
pueden ser reutilizadas repetidamente.
 VENTAJAS DESVENTAJAS
• Aumento de la • La alteración de la
estabilidad de la conformación de la
enzima enzima
• La posible • La gran
reutilización del heterogeneidad
derivado • Hay una pérdida de
• La posibilidad de actividad enzimática
diseñar un reactor • El biocatalizador es
enzimático de fácil mas caro que la
manejo y control enzima nativa
adaptado a la
aplicación de la
enzima inmovilizada
 Propiedades tecnológicas de los sistemas de
inmovilización enzimática
.
 Factores que influyen en el rendimiento
de la enzima inmovilizada
.
Reactores enzimáticos que emplean
enzimas inmovilizadas.
 Factores que influyen en el rendimiento
de la enzima inmovilizada
.
 Clasificación de los soportes de inmovilización
.
 MÉTODOS DE
INMOVILIZACIÓN
DE ENZIMAS
 METODOS DE INMOVILIZACION:

Retención física Inmovilización química

Atrapamiento o
Adsorción Unión covalente Entrecruzamiento
inclusión
ATRAPAMIENTO
 ATRAPAMIENTO

 FUNDAMENTO: retención física de la enzima

en las cavidades interiores de una matriz
sólida porosa.
Prepolímeros fotoencruzables del tipo
poliacrilamida: colágeno, alginato,
carraginato o resinas poliuretano.

 VENTAJAS: requiere poca cantidad de

Enzimas y la Enzima no sufre alteración en
su estructura
 PROCESO

Susp.
Enzim Cambio de
a en T o adición Polimeriza-
sol. reactivo ción
monó químico
mero

Atrapamiento en
geles o fibras
resistentes
 INCLUSIÓN EN MEMBRANAS

MICROENCAPSULACIÓN REACTORES
MEMBRANA
 FUNDAMENTO: las (INDUSTRIA)
enzimas están rodeadas de  Permeable: sustrato
membranas inicial
semipermeables que
 Permeable: Producto
permiten el paso de
sustratos y producto no E. final
 Impermeable: Enzima
 Permanentes:
polimerización interfacial.
 No permanente:
surfactantes
i. UNION A SOPORTES.

Los soportes son materiales utilizados para la

inmovilización enzimática. Para la elección del
soporte se debe tener en cuenta el tipo de enlace,
para llevar a cabo la unión del biocatalizador.
Tomando en cuenta que la inmovilización.

o Incremente la afinidad del sustrato,

Disminuya la inhibición
o Amplié el intervalo de pH optimo,
reduciendo contaminantes microbianos.
 Los soportes difieren de tamaño, densidad, porosidad
y forma. Por lo que se clasifican en 2 grupos.

1. Soportes Inorgánicos. Pueden ser

naturales(arcilla de bentonita, sílice) ò manu
fracturados (oxido de metales y vidrio, alúmina,
cerámicas, gel de sílice).

2. Soportes orgánicos. Pueden ser Polímeros

naturales (Polisacáridos: celulosa, almidón,
dextrosa, quitina, etc.) ò polímeros sintéticos
(Poliolefinas: poliestireno, polímeros acrìlicos)
otros como poliamidas.
ii. Adsorción iónica.
La enzima se une a un soporte sin funcionalizar mediante
interacciones iònicas, Fuerzas de Van der Waals ò por puentes
de Hidrógeno.

Factores que influyen en la ADSORCION.

a.- pH
b.- Fuerza iónica
c.- Diámetro del poro
d.- Presencia de Iones.

VENTAJAS. Preparación sencilla, bajo costo, no existe cambios

en especificidad enzimática, estables en el trabajo con bajo
contenido de agua.
DESVENTAJAS. Optimización de las variables que controlan la
adsorción, inestables al finalizar el derivado, la unión del
soporte es débil.
 iii.- Unión covalente.

Activación de
Nucleófilos de las
grupos químicos
proteínas.
del soporte

Los más
empleados para la Lisina.
formación de Cisteína.
enlaces de Tirosina.
soporte: Histidina.

Metionina.
Triptófano.
En menor medida: Arginina.
Ácido Aspártico y
Glutámico.
 Ventajas.
1. La
manipulación
2. La carga de
de los
enzima
derivados
permanece
inmovilizados
constante
es sencilla.
después de la
inmovilización.

3. Los derivados
pueden utilizarse
en reactores en 4. Una mayor resistencia
continuo, a la desactivación por el
empaquetados, de efecto de la temperatura,
lecho fluidizado o de los disolventes
tanque agitado. orgánicos o del pH, al
tener estabilizada su
estructura terciaria.
 Inconvenientes.

Conocer la densidad de
Conduce a derivados
grupos activos por
inactivos.
unidad de superficie

El proceso de
inmovilización puede Inhibidor que bloquee el
alterar la estructura del centro activo.
centro activo.

La inmovilización
covalente no es
aconsejable en enzimas
sensibles a cambios de
pH, fuerza iónica, etc.
 iv.- Reticulado.

Dialdehídos.
Uso de reactivos bifuncionales
Diiminoésteres.
que originan uniones
Diisocianatos.
intermoleculares entre las
Sales de bisdiazonio.
moléculas de enzima.
Diaminas.

Enzimas con enlaces Resisten condiciones extremas

intermoleculares irreversibles. de pH y temperatura.
 Método más novedoso de
reticulado consiste en la
cristalización de enzimas y su
posterior reticulado con
glutaraldehído.

De esta manera la propia

enzima actúa como soporte, y
su estructura terciaria está
estabilizada por las uniones
covalentes intermoleculares.
La estructura cristalina
posee canales
microscópicos (20-
50Å) que permiten el
paso de sustratos hasta
el centro activo de la
enzima donde se
cataliza la reacción.
Estos cristales pueden
soportar temperaturas
elevadas y pH
extremos, así como la
acción de las proteasas.

Obtención de
compuestos
enatioméricamente
puros y en la síntesis de
péptidos.
 EFECTOS DE LA INMOVILIZACION

A menudo, la inmovilización altera significativamente

el comportamiento de las enzimas.

Se producen cambios en su estabilidad

La enzima inmovilizada es un sistema heterogéneo en

el que todos los componentes se encuentran en
interfase
 Efectos en la estabilidad
 se observa un incremento en la estabilidad de las
enzimas después de su inmovilización, que se debe
principalmente a las siguientes razones:
Una estabilización
conformacional de la
Una protección frente
enzima debido a la
a las proteasas en el
existencia de uniones
multipuntuales enzima- medio
soporte

Se evita la agregación Existe una alteración

intermolecular al
del microentorno del
mantener las moléculas
enzima debida a la
de enzima retenidas en
una determinada región interacción de la
del espacio. enzima con el soporte
 APLICACIONES DE LA ENZIMAS
INMOVILIZADAS

 Las aplicaciones más importantes de las enzimas

inmovilizadas se pueden clasificar en:
 1. Aplicaciones analíticas: biosensores
 2. Aplicaciones médicas: tratamientos con enzimas
inmovilizadas
 3. Aplicaciones industriales: en la industria química,
farmacéutica, alimentaria y
 4.- tratamiento de aguas residuales
 Perdida de la actividad enzimática por la
inmovilización
 1. la unión al soporte se produce de tal forma que el paso del
sustrato al centro activo está impedido,
 2. los grupos reactivos del soporte reaccionan con algún
aminoácido que forme parte del centro activo o que sea
esencial para la actividad catalítica de la enzima,
 3. la inmovilización puede originar un cambio conformacional
que da lugar a una forma inactiva,
 4. las condiciones experimentales del proceso causan la
desnaturalización o desactivación de la enzima. Si la pérdida
de actividad no es total después de la inmovilización, los
cambios (disminución o aumento de la actividad enzimática)
se deberán principalmente a efectos difusionales,
electrostáticos, estéricos y/o del microentorno.
1 2 Efecto sobre la
actividad enzimática
Si pierde totalmente la actividad
enzimática puede ser debido a :

1.la unión al soporte .(entrecruzamiento)

2. los grupos reactivos del soporte

reaccionan con algún aminoácido que
forme parte del centro activo o que sea
esencial para la actividad catalítica de la
enzima.

3. un cambio conformacional.

Una protección frente a las proteasas 4. las condiciones experimentales del

en el medio. proceso.
Reticulado
También denominado entrecruzamiento o cross-linking. El
resultado del reticulado son enzimas con enlaces
intermoleculares irreversibles capaces de resistir condiciones
extremas de pH y temperatura.
 EFECTOS
EFECTOS DIFUCIONALES
ESTERICOS

EFECTOS
ELECTROSTATICOS
 EFECTOS DIFUNCIONALES
Como consecuencia de la inmovilización, la difusión de los sustratos
hacia el centro activo de la enzima puede estar impedida por:

E. DIFUNCIONALES

a) b)

Resistencias Resistencias difusionales

difusionales internas:
externas:
 Resistencias difusionales externas:

Las enzimas inmovilizadas están generalmente en la superficie

interna de los soportes porosos o confinadas en matrices.

Si no existe enzima ocluida en el interior de los poros de la

partícula de soporte o si el sustrato no penetra en el interior
de los mismos, sólo se está en presencia de un fenómeno
de transporte de masa externo.

Del gel, microcápsula,

fibra o poro del
soporte donde se
encuentra la enzima
inmovilizada.
Se supone que la enzima está sólo fijada a la superficie externa de
la partícula soporte y en consecuencia sólo se deberá considerar
transporte de masa desde el seno de la solución hacia la superficie
del soporte.

Resistencias difusionales internas:

Por el contrario, si la enzima está localizada en el interior de la

partícula soporte y el sustrato se debe movilizar desde la
superficie al interior para que la reacción pueda ocurrir,
el fenómeno es de transporte de masa interno (Abureesh, 1997) .
Si el soporte es insoluble en el medio de reacción, el sustrato
deberá atravesar la película líquida estacionaria (capa de Nernst
o de disfusión) que rodea el soporte.

Del gel, microcápsula,

fibra o poro del soporte
donde se encuentra la
enzima inmovilizada.

En las proximidades de un soporte no cargado, la concentración

de sustrato es menor que en el resto de la disolución, puesto que
existe un gradiente de concentración a través de la zona de
difusión. Por tanto, los valores de km para las enzimas
inmovilizadas son siempre aparentes (km’);
Existen diversas maneras de minimizar estos efectos difusionales
como por ejemplo: disminuir el tamaño del biocatalizador,
aumentar la concentración de sustrato, incrementar la agitación o
el flujo en el reactor, etc. Con estas medidas se consigue reducir
el grosor de la capa de Nernst, y como consecuencia, el valor de
km’ disminuye.
 EFECTOS ESTÉRICOS

 Sustrato de bajo peso molecular no hay

pérdida apreciable de su actividad.

 Sustrato de elevado peso molecular,

disminuye drásticamente la actividad de la
enzima inmovilizada.
 EFECTOS ELECTROSTATICOS ENTRE
EL SUSTRATO Y EL SOPORTE

Si tienen la misma carga existe una repulsión mutua, mientras

que si las cargas son opuestas hay atracción. Cuando el
sustrato y el soporte tienen cargas opuestas, el valor de km’
aparente puede verse reducido hasta varias veces por debajo
del obtenido en disolución. Hornby y cols. desarrollaron una
expresión matemática que permite calcular la actividad de
las enzimas inmovilizadas, teniendo en cuenta tanto los
factores de difusión como los electrostáticos. La expresión
de Michaelis-Menten en este caso es:
La expresión de Michaelis-Menten en este caso es:

v= donde

k1m = ( km + )

x=espesor de la capa de Nernst

D=coeficiente de difusión
T=temperatura (ºK)
z=valencia del sustrato
F=constante de Faraday
R=constante universal de los gases
V=gradiente de potencial en el soporte.
 VENTAJAS

1. El aumento de la estabilidad de la enzima.

2. La posible reutilización del derivado, por lo que disminuyen

los costes del proceso.

3. La posibilidad de diseñar un reactor enzimático de fácil

manejo y control, adaptado a la aplicación de la enzima
inmovilizada.
Permiten el empleo de cargas elevadas de enzima, la cual
mantendrá su actividad durante más tiempo. Estos sistemas
pueden incluir el reciclado, lo que permite la obtención de
productos con mayor pureza.
 DESVENTAJAS

1. La alteración de la conformación de la enzima respecto de su

estado nativo.

2. La gran heterogeneidad del sistema enzima-soporte

donde pueden existir distintas fracciones de proteínas
inmovilizadas con un diferente número de uniones al soporte.

3. Siempre suele haber una pérdida de actividad de la enzima

durante la movilización.

4. El biocatalizador es más caro que la enzima nativa

 Productos obtenidos empleando enzimas
inmovilizadas
.
 ¿Cómo se inmovilizan enzimas
utilizadas en los alimentos?
Haciendo leche sin lactosa
Lactasa inmovilizada se puede utilizar para producir leche sin lactosa: leche
normal se vierte en una columna que contiene las enzimas de lactasa
inmovilizada, que descomponen la lactosa. Después de la leche ha pasado a
través de este sistema, que sólo contendrá los productos de la reacción
(glucosa y galactosa), por lo que las personas intolerantes a la lactosa (y
gatos) puede beberla.
 ¿Cómo se inmovilizan enzimas
utilizadas en los alimentos?
Jugo de frutas
Las frutas contienen pectinas, carbohidratos que se encuentran en la pared
celular que mantienen la estructura de la célula. La pectinasa inmovilizada
se puede utilizar para romper estas pectinas, aflojando las conexiones entre
las células. Esto aumenta la cantidad de jugo que puede obtener de la fruta,
además hace que el jugo sea más líquido y se deshace de la turbidez que
pectinas pueden causar.
 ¿Cómo se inmovilizan enzimas
utilizadas en los alimentos?
Jarabe de maíz con alta fructuosa
La producción de jarabe de maíz de alta fructosa (JMAF) es el mayor uso
industrial de enzimas inmovilizadas. La enzima glucosa isomerasa se
inmoviliza, y esta enzima convierte la glucosa en el jarabe de maíz a la
fructosa, la cual hace que sea más dulce.
 ¿Cómo se inmovilizan enzimas utilizadas
en biosensores?
Tiras reactivas de glucosa
Las personas con diabetes tipo 1 carecen de la hormona insulina, así que
tienen que poner a prueba sus niveles de azúcar en la sangre con
regularidad para asegurar que se mantengan dentro de un rango saludable.
Lo hacen mediante la medición de la cantidad de glucosa en la sangre con
una tira de prueba de glucosa. En la tira de ensayo contiene la enzima
glucosa oxidasa inmovilizada; cuando la glucosa está presente, la enzima
cataliza una reacción que cambia la glucosa en peróxido de hidrógeno y
ácido glucónico.
 ¿Cómo se inmovilizan enzimas utilizadas
en biosensores?
La detección de pesticidas
Algunos pesticidas y otras toxinas son perjudiciales, ya que inhiben la
enzima acetilcolinesterasa (AChE). AChE descompone el neurotransmisor
acetilcolina, que es un muy importante químico cerebral. Sin AChE, la
acetilcolina se acumula en el sistema nervioso, lo que interfiere con las
señales nerviosas y provocando problemas musculares, respiratorios y
cardíacos.