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Module 1 – Biologie

cellulaire

Partie IV: Méthodes d’étude


de la cellule

cours E. Grelier 1
Plan
I. Techniques de séparation et de
purification cellulaire
II. Méthodes d’étude de la morphologie
des cellules : techniques d’examens
microscopiques
III. Méthodes d’étude de la composition
biochimique des cellules
IV. Méthode d’étude du métabolisme
cellulaire
V. La culture cellulaire

cours E. Grelier 2
I. Techniques de
séparation et de
purification cellulaire

1. Séparation des cellules


d’un tissu

cours E. Grelier 3
I. Techniques de séparation et
de purification cellulaire
1. Séparation des cellules d’un tissu

Tissu = ensemble cohérent de cellules

Photographie au microscope optique (grossissement de 400 x) d'un tissu épithélial simple pavimenteux péritonéal humain
http://biology.clc.uc.edu/Fankhauser/Labs/Bio_Lab113/Tissues/Human_Histology.html

d’où
-> nécessité d’un traitement pour dissocier les liaisons intercellulaires et
pouvoir étudier les cellules isolées (sauf cas du sang).

cours E. Grelier 4
I. Techniques de séparation et
de purification cellulaire
1. Séparation des cellules d’un tissu
 1ière étape : Destruction de la matrice
extracellulaire et des jonctions intercellulaires
• Traitement des tissus par des enzymes
protéolytiques (trypsine, collagènase)
• Traitement des tissus par des agents chélateurs des
cations divalents impliqués dans les ponts
intercellulaires (EDTA : Ethylène Diamine Tétra
Acétate)

 2ième étape : Isolement des cellules


• Dissociation par une agitation mécanique douce grâce
à
• une presse à tissus,
• des aspirations et refoulements d’une pipette ou d’un
piston (tube de Potter, homogénéisateur de Dounce),
• un vortex…
• Filtration (sur gaze par exemple) pour obtenir une
suspension cellulaire homogène

cours E. Grelier 5
I. Techniques de
séparation et de
purification cellulaire

2. Purification

cours E. Grelier 6
I. Techniques de séparation et
de purification cellulaire
2. Purification: adhérence et gradient

 Adhérence des cellules


• GR et monocytes au plastique ou aux fibres de nylon : élimination après
incubation sur un support plastique pendant 1 heure à 37°C
• kératinocytes (suspension de cellules de peau) au collagène I après 15 min à
37°C.

 Centrifugation sur gradient de densité


• Séparation selon leur densité, liée au contenu cellulaire et à la taille.
• Dépôt de la suspension cellulaire sur un liquide de densité choisie en
fonction des cellules à séparer.
• Centrifugation
• Migration des cellules dans le liquide et localisation selon leur densité
formant un anneau à récupérer par simple pipetage.

cours E. Grelier 7
I. Techniques de séparation et
de purification cellulaire
2. Purification: exemple
Séparation des lymphocytes à partir d’une suspension de cellules spléniques en
gradient de Ficoll

 Les solutions utilisées : Dépôt


• solutions de polymères de sucres de d’un volume de sang (d = 1,006)
composition variable sur un volume de Ficoll (d=1,077)
• de densités différentes permettant la
séparation de cellules de différentes
densités.
Centrifugation 30 minutes à 500 g à 18-20 °C
 Technique
• très simple,
• peu onéreuse Plasma

• mais peu sélective Anneau de lymphocytes (+M et plaquettes)

• ne permettant pas de séparer des cellules Ficoll


de densité proches. Culot contenant polynucléaires et hématies

cours E. Grelier 8
 I. Techniques de séparation et
de purification cellulaire
2. Purification: cytomètre de flux
 Cytométrie de flux vidéo cytométrie
• Cellules alignées en flux
• Examen individuel de chaque cellule par un rayon LASER lui affectant
• des paramètres spécifiques (Taille, Granularité,…)
• une charge électrique
• Tri des fractions par déviation des cellules chargées au niveau de plaques
Variante : FACS (Fluorescent Activated Cell Sorting) utilisant
• Même principe avec
• marquage préalable des cellules par un conjugué fluorescent (Ac couplé à un
fluorochrome)
• détection de cette fluorescence
• tri selon le même principe que précédemment.
• Technique
• extrêmement spécifique,
• rapide
• automatisable
• nécessitant un appareillage sophistiqué et coûteux de
cytomètre/ordinateur/logiciel

cours E. Grelier 9
Arrivée de la suspension à analyser grâce à une légère
surpression dans une tubulure qui assure le centrage
hydrodynamique du jet

Passage des cellules par un microorifice (50 à 70 µm de


diamètre) polarisé permettant la mesure du volume
cellulaire

Interception de plusieurs faisceaux lumineux, mesure de la


fluorescence émise, de la diffusion ou de la diffraction à
différents angles* à l’aide de photomultiplicateurs

Sortie du jet fractionné grâce à un dispositif


d’ultrasons en gouttelettes par un deuxième microrifice
(70 à 100 µm) et charge

Déviation grâce à un champ de haute tension selon les


instructions données après traitement des données

Acquisition et traitement des signaux provenant des


différents détecteurs : affichage à l’écran et
stockage des résultats

Tri et recueil des cellules en tubes ou plaques de


microtitration

*La diffusion aux grands angles (90°) de la lumière traversant la cellule donne des informations sur la forme,
la structure et le volume de la cellule et de son noyau tandis quecours
la diffusion aux petits angles de la lumière
E. Grelier 10
diffractée par des petites particules donne des renseignements sur la granularité cytoplasmique.
Un exemple d’analyse avec un
cytomètre de flux : l’analyse des
cellules sanguines
 Voir vidéo sur l’intérêt dans l’étude de
l’évolution de l’infection par le VIH : (à partir de 13 min 47)

http://www.canal-u.tv/video/science_en_cours/la_cytometrie_en_flux.36

cours E. Grelier 11
 I. Techniques de séparation et
de purification cellulaire
2. Purification: chromatographie d’affinité
• Connaissance d’une molécule de surface spécifique du type cellulaire à trier
• Lectines : protéines d’origine végétale se fixant avec une grande affinité à des
groupements glucidiques spécifiques rencontrés au niveau des glycoprotéines
présentes à la surface des cellules
• Anticorps spécifiques des cellules d’intérêt
• Couplage de cette molécule à diverses matrices (billes de plastique ou de latex)
placées dans une colonne
• Dépôt de la suspension cellulaire à trier sur la colonne ainsi formée
• Fixation des cellules d’intérêt
• Récupération par
• agitation modérée
• changement de pH
• changement de force ionique
• pour casser les liaisons faibles formées entre ligands.
Technique
• spécifique,
• relativement peu onéreuse (régénération de la colonne)
• nécessitant un compromis efficace pour éluer toutes les cellules retenues pour avoir un bon
rendement sans pour autant les altérer.

cours E. Grelier 12
I. Techniques de séparation et de
purification cellulaire
2. Purification: chromatographie d’affinité

http://espacesciences.com/Techniques/sepmol/Chromato/
ndev/coursepmol.htm

cours E. Grelier 13
I. Techniques de séparation et de
purification cellulaire
2. Purification: Tri immunomagnétique
 Tri immunomagnétique
Principe de cette technique très semblable à celui
de la chromatographie d’affinité Incubation
• Connaissance d’une molécule de surface spécifique
du type cellulaire à trier
• Utilisation contre cette molécule d’un anticorps
couplé à une bille métallique à base de fer.
• Incubation de la suspension cellulaire avec cet
anticorps
Retenue
• Dépôt de cette suspension sur une colonne placée
dans un champ magnétique crée par un aimant.
• Retenue des cellules marquées
• Récupération de ces cellules après retrait de
l’aimant
Technique
• très spécifique,
• rapide
• d’un bon rendement. Élution
• assez onéreuse (colonnes à usage unique).

cours E. Grelier 14
II. Méthodes d’étude de la
morphologie des cellules :
techniques d’examens
microscopiques

1. Grossissement et
résolution

cours E. Grelier 15
Nécessité du grossissement

Cellule végétale

Virus/ribosome

Macromolécule
Cellule animale

Molécule
Bactérie

Atome
1 cm 1 mm 100µm 10 µm 1 µm 100 nm 10 nm 1nm 0,1 nm

Œil nu
Microscope photonique
Microscope électronique

cours E. Grelier 16
II - Techniques d’examen microscopique
1. Grossissement et résolution

Grossissement du microscope =

Grossissement de l’objectif x Grossissement de l’oculaire

Limite du grossissement : le pouvoir de résolution de l’œil sur celui du


microscope :

• En microscopie photonique, avec les pouvoirs de résolution de l’instrument et de


l’œil, le grossissement limite est de 1000
• En microscopie électronique à transmission, le grossissement maximal que de 1 000
000

cours E. Grelier 17
II - Techniques d’examen microscopique
1. Grossissement et résolution
 Le pouvoir de résolution est
• une propriété instrumentale,
• une valeur absolue et théorique
• la meilleure résolution atteignable pour un instrument particulier et
dans des conditions d’observation optimum
 La résolution est
• une valeur dépendant des conditions expérimentales d’observation
• égale ou inférieure au pouvoir de résolution
• la possibilité de distinguer des points rapprochés d’objets
distincts
 La limite de résolution est la plus petite distance séparant deux points
reconnus comme objets distincts
• 75 µm pour l’œil nu
• 0,25 µm pour les meilleurs microscopes photoniques
• 0,002 µm pour les microscopes électroniques à transmission
cours E. Grelier 18
II - Techniques d’examen microscopique
1. Grossissement et résolution: exercices
Calcul de d : limite de résolution λ = longueur d’onde du faisceau lumineux
d = 1/PR = c λ / n sin α n = indice de réfraction du milieu
α = angle de demi ouverture de l’objectif
c = constante = 0,61

Déductions théoriques Applications pratiques

Diminution de λ diminue, Microscope à épifluorescence


d et avec UV
augmentation n augmente, Utilisation de l’huile à immersion
de PR si
a augmente Ouverture augmentée à la
construction

cours E. Grelier 19
II - Techniques d’examen microscopique
1. Grossissement et résolution: exercices
 Indiquer si des objets distants de 3 µm, 300 nm, 3000 Å peuvent être discernés
pour le matériel utilisé suivant : un bon microscope photonique équipé d’un oculaire
x10 et d’un objectif à immersion x 100 et d’une limite de résolution de 2,5 µm .

 Calculer d dans le cas


• où un filtre violet est disposé sur la source lumineuse (λ = 400 nm) sachant que d = 1 µm
en lumière jaune (λ = 570 nm)
• où la mise au point est faite à sec sans huile à immersion.
Données nhuile = 1,6
d1 = c λ1/nh . sin α et d2 = c λ2/n . sin α d’où d2 = d1 λ2/ λ1 = 400/570 = 0,7
d1 = c λ1/nh . sin α et d2’ = c λ1/ne . sin α d’où d2’ = nh x d1 / ne = 1,6

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II. Méthodes d’étude de la
morphologie des cellules :
techniques d’examens
microscopiques

2. Préparations pour
l’observation microscopique

cours E. Grelier 21
II - Techniques d’examen microscopique
2. Préparation pour l’observation microscopique
Schémas de principe des microscopes
Photonique Électroniques à transmission (MET) à balayage (MEB)

Source d’électrons :
Source de photons : filament chauffé soumis
lampe à une forte ddp

>100 kVolts 1 à 40 kvolts


Condenseur
Condenseur

Grille de cuivre
Lame support support objet
objet transparent transparent
Bobines déflectrices
donnant un faisceau
Objectif(s)
Objectif mobile d’électrons
réglables
balayant l’objet
Image vidéo

Vide
Oculaire

Projectif
Détecteur

Écran fluorescent Objet non


Oeil
Plaque photographique transparent

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II - Techniques d’examen microscopique
2. Préparation pour l’observation microscopique
1. en cas de microscopie à lumière

 L’observation par transmission exige que les


rayons lumineux traversent l’objet.

 Ainsi l’objet doit être de faible épaisseur

cours E. Grelier 23
II - Techniques d’examen microscopique
2. Préparation pour l’observation microscopique
1. en cas de microscopie à lumière

 L’objet doit être de faible épaisseur

Il faut donc réaliser une coupe : microtomie

Pour cela, il faut durcir l’échantillon : inclusion

Pour cela, il faut fixer les structures car le durcissement peut


les altérer

cours E. Grelier 24
II - Techniques d’examen microscopique
2. Préparation pour l’observation microscopique
1. en cas de microscopie à lumière

On récapitule :
Fixation pour
consolider

Inclusion pour
durcir l’échantillon

Microtomie pour
couper

Coloration pour
le contraste

cours E. Grelier 25
II - Techniques d’examen microscopique
2. Préparation pour l’observation microscopique
1. en cas de microscopie à lumière

Etape 1: la fixation
Elle peut être chimique: Elle peut être physique:
avec des fixateurs la congélation (qui doit
coagulants (pour les être rapide): c’est la
tissus) ou non coagulants meilleure technique.
(cytologie).

cours E. Grelier 26
II - Techniques d’examen microscopique
2. Préparation pour l’observation microscopique
1. en cas de microscopie à lumière

Etape 2: l’inclusion
l'eau des cellules est remplacée
par de la paraffine chaude qui
durcit en refroidissant.

NB: Le remplacement de l'eau par la paraffine n'est pas directement possible:


ces deux liquides n'étant pas miscibles. On doit en premier lieu substituer à l'eau
des cellules fixées de l'éthanol, puis du toluène qui peut se mélanger à la
paraffine liquide chaude.
On peut aussi durcir avec la congélation.

cours E. Grelier 27
II - Techniques d’examen microscopique
2. Préparation pour l’observation microscopique
1. en cas de microscopie à lumière

Etape 3: la coupe
On utilise un microtome : rasoir d’acier
Après inclusion à la paraffine : coupes de 2 à 5 μm,
Après congélation : coupes de 5-10 μm.

NB : Lorsqu'on travaille avec des échantillons congelés, le


microtome est équipé d'une enceinte maintenue à -20°C.

http://www.youtube.com/watch?v=1lY1CDKfj
1M

cours E. Grelier 28
II - Techniques d’examen microscopique
2. Préparation pour l’observation microscopique
1. en cas de microscopie à lumière

La coloration
Colorants vitaux Colorants non vitaux

Ils ne tuent pas les cellules mais sont Ils tuent la cellule et nécessitent
peu nombreux une fixation de la cellule au
Ex: rouge neutre préalable.

Observation de cellules d’oignons au microscope


photonique

cours E. Grelier 29
II - Techniques d’examen microscopique
2. Préparation pour l’observation microscopique
2. En cas de microscopie électronique

a/ Préparation

1/ L’observation se fait sous-vide, il faut donc déshydrater


l’échantillon pour éviter le bouillonnement.

Vidéo

cours E. Grelier 30
II - Techniques d’examen microscopique
2. Préparation pour l’observation microscopique
2. En cas de microscopie électronique

On récapitule :
Fixation pour
consolider

Déshydratation

Inclusion pour Vidéo


durcir l’échantillon

Ultra microtomie pour


couper

Obtention
de contraste
cours E. Grelier 31
II - Techniques d’examen microscopique
2. Préparation pour l’observation microscopique
2. En cas de microscopie électronique

b/ Contraintes spécifiques au MET

Le support de l’échantillon doit être perméable aux électrons :


membrane de carbone ou d'un polyvinyle comme le formvar).
Ce support est lui-même soutenu par une grille de cuivre de 3 mm
de diamètre à maille fine (maille de 100 à 300 μm de côté)

cours E. Grelier 32
II - Techniques d’examen microscopique
2. Préparation pour l’observation microscopique
2. En cas de microscopie électronique

b/ Contraintes spécifiques au MET

L’observation des spécimens par transmission ne


donne des renseignements que si certaines régions
diffusent plus les électrons que d'autres et
présentent donc des contrastes.

Les éléments avec un numéro atomique faible laissent


passer les électrons contrairement aux éléments
avec un numéro atomique fort (or/ tungstène…)

cours E. Grelier 33
II - Techniques d’examen microscopique
2. Préparation pour l’observation microscopique
2. En cas de microscopie électronique

b/ Contraintes spécifiques au MET: Obtention de contrastes.

- Technique de l'ombrage = vaporisation sous vide des métaux avec une direction
faisant un angle faible avec le plan de la préparation (= sous incidence rasante). Les
vapeurs métalliques viennent se déposer sur la membrane-support et à la surface des
objets, mais chaque objet forme un obstacle au dépôt métallique. On obtient ainsi un effet
d'ombre sur la membrane support.

.
Fibriline en forme d’étoiles
regroupées en chaîne. C’est un
constituant du cartilage

http://temsamprep.in2p3.fr/fiche/fiche.php?l
cours E. Grelier 34
Filament d’adn déroulé ang=fr&fiche=32
II - Techniques d’examen microscopique
2. Préparation pour l’observation microscopique
2. En cas de microscopie électronique

b/ Contraintes spécifiques au MET: Obtention de contrastes.

Pillis autour d’une bactérie dont on


distingue une partie en bas.

http://temsamprep.in2p3.fr/fiche/fiche.php?l
cours E. Grelier 35
ang=fr&fiche=32
II - Techniques d’examen microscopique
2. Préparation pour l’observation microscopique
2. En cas de microscopie électronique

b/ Contraintes spécifiques au MET: Obtention de contrastes.

- Technique de coloration négative : on place les objets dans une solution aqueuse
d'acide phosphotungstique et on dépose une gouttelette de cette suspension sur une grille
recouverte d'une membrane-support.
 En séchant l’acide phosphotungstique forme entre les structures un écran que les
électrons ne peuvent traverser.
 Les électrons traversent les structures que l’on veut observer: image en négatif.

Particules de rotavirus en microscope électronique en coloration


négative (x 198000)
(Cliché : collection du Pr. M. Castets, service de microscopie
électronique (Pr. Ph. Rabin) CHU de Poitiers, France)

cours E. Grelier 36
II - Techniques d’examen microscopique
2. Préparation pour l’observation microscopique
2. En cas de microscopie électronique

b/ Contraintes spécifiques au MET: Obtention de contrastes.

- - Les bains dans les sels de métaux lourds.


- - Ac marqués

cours E. Grelier 37
II - Techniques d’examen microscopique
2. Préparation pour l’observation microscopique
2. En cas de microscopie électronique

c/ Contraintes spécifiques au MEB.

Les échantillons biologiques déshydratés


sont isolants donc il faut rendre leur
surface conductrice: vaporisation sous vide
d’une mince couche d’or ou de platine
dans le cas du MEB

cours E. Grelier 38
II - Techniques d’examen microscopique
2. Préparation pour l’observation microscopique
2. En cas de microscopie électronique

d/ Observation de coupes épaisses.

Pour mieux comprendre la disposition des


structures dans l'espace : Coupes épaisses.
L'utilisation de microscopes électroniques à
haute tension (1 à 3 millions de volts)

cours E. Grelier 39
II - Techniques d’examen microscopique
2. Préparation pour l’observation microscopique
2. En cas de microscopie électronique

e. La cryofracture

- « sandwich » d'échantillon d'une épaisseur de l'ordre de 20


micromètres.
- Vitrification de l’échantillon à – 200°C

- Séparation des deux plaquettes de cuivre

cours E. Grelier 40
II - Techniques d’examen microscopique
2. Préparation pour l’observation microscopique

La cryofracture

- L'échantillon est alors fracturé. La ligne de fracture passe par les


zones de moindre résistance, séparant l'échantillon en deux
parties.
- Projection du mélange platine-carbone à 45° sur la surface
fracturée de l'échantillon. Ce procédé permet d'obtenir une réplique
de la surface.

cours E. Grelier 41
II - Techniques d’examen microscopique
2. Préparation pour l’observation microscopique

La cryofracture

 Le carbone est traversé par les électrons


 Le platine les arrête de façon plus ou moins totale selon l'épaisseur
rencontrée par le faisceau.
• Zones riches en platine qui apparaissent en noir sur le film photographique
• zones sans relief: grises et
• zones sans platine: blanches.

 Dans bien des cas, elle permet d'obtenir de précieuses


informations sur la structure de l'échantillon.

cours E. Grelier 42
II - Techniques d’examen microscopique
2. Préparation pour l’observation microscopique

La cryofracture

cours E. Grelier 43
 une image obtenue par
cryodécapage montrant
l'organisation membranaire
de la cellule (à gauche, le
noyau, à droite des nappes
de réticulum
endoplasmique).

cours E. Grelier 44
II. Méthodes d’étude de la
morphologie des cellules :
techniques d’examens
microscopiques

3. Microscopie photonique

cours E. Grelier 45
II - Techniques d’examen microscopique
3. Microscopie photonique
Rappel: Schémas de principe du microscope photonique

Source de photons :
lampe

Condenseur

Lame support
objet transparent

Les échantillons biologiques observés Objectif


sont traversés par la lumière.

Oculaire

Oeil

cours E. Grelier 46
3. Microscopie photonique
Types particuliers de microscopies photoniques: le microscope
à contraste de phase

Utilisation des différents


indices de réfraction des
milieux traversés par la
lumière pour contraster
les structures cellulaires
sans coloration.

Intérêt: possibilité
d’observer des cellules
vivantes et leur
mouvement en
microcinématographie
accélérée
cours E. Grelier 47
3. Microscopie photonique
Types particuliers de microscopies photoniques: le microscope
à épifluorescence

Utilisation des marqueurs


(fluorochromes : fluorescéine,
rhodamine) capables
- d’absorber un rayonnement de
faible longueur d’onde et de
forte énergie émis par une
source d’UV et
- d’émettre (par excitation) un
rayonnement de grande longueur
d’onde mais de faible énergie
dans le visible
Observation de l’ADN avec un
- NB: chlorophylle par exemple ne microscope à épifluorescence
après utilisation de fluorochrome
nécessite pas l’utilisation de
fluorochrome.
http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/Microscopie/fluo/fluo.htm

cours E. Grelier 48
3. Microscopie photonique
Types particuliers de microscopies photoniques: le microscope
à épifluorescence

Rappelez-vous : quel est l’impact de l’utilisation


d’UV plutôt que de la lumière blanche sur la limite
de résolution ?

Déductions théoriques Applications pratiques

Diminution de λ diminue, Microscope à épifluorescence


d et avec UV
augmentation n augmente, Utilisation de l’huile à immersion
de PR si
a augmente Ouverture augmentée à la
construction

cours E. Grelier 49
3. Microscopie photonique
Types particuliers de microscopies photoniques :
le microscope à épifluorescence

Un microscope à épifluorescence amélioré : le


microscope confocal
Exploitation du principe de la fluorescence émise par plusieurs composés
excités par un rayonnement cohérent (LASER) qui balaye l’objet en largeur et
en profondeur : la détection de l’image sélectionnée par un filtre précis
(éliminant les émissions parasites) permet une reconstitution par ordinateur
d’images éventuellement en trois dimensions

cours E. Grelier 50
II. Méthodes d’étude de la
morphologie des cellules :
Techniques d’examens
microscopiques

4. Microscopie électronique

cours E. Grelier 51
4. Microscopie électronique
Principe

 Ce n’est plus de la lumière qui est utilisée mais un flux


d’électrons.
 Les électrons en mouvement créent une onde de longueur d'onde
plus courte que celle de la lumière.

La limite de résolution d'un microscope électronique sera donc plus


petite et le pouvoir séparateur plus élevé que celui d'un microscope
photonique.

cours E. Grelier 52
4. Microscopie électronique

* Inconvénients :

1/ Les ë ne se propagent que dans le vide très poussé ce qui empêche toute
observation sur le vivant ;

2/ La pénétration des ë dans la matière est très faible, donc les coupes doivent
être très minces (de l'ordre de 0,06 à 0,09 μm ~ 0,1 μm pour 2 à 5μm en
microscopie photonique) ; on utilisera un ultramicrotome.

cours E. Grelier 53
4. Microscopie électronique
Schémas de principe des microscopes
Électroniques à transmission (MET) à balayage (MEB)

Source d’électrons :
filament chauffé soumis
à une forte ddp

>100 kVolts 1 à 40 kvolts

Condenseur

Grille de cuivre
support objet
transparent
Bobines déflectrices
donnant un faisceau
Objectif(s)
mobile d’électrons
réglables
balayant l’objet
Image vidéo

Vide

Projectif
Détecteur

Objet non
Écran fluorescent
transparent
Plaque photographique

cours E. Grelier 54
4. Microscopie électronique : Le MET

Ce sont les ë qui traversent l'échantillon qui contribuent


directement à la formation de
l'image. On ne peut qu'observer des objets très minces,
généralement on s'adresse à des coupes.

Observation d’un chloroplaste au MET

Vidéo

cours E. Grelier 55
4. Microscopie électronique: Le MEB

Les échantillons sont bombardés par un faisceau d'ë, mais seuls sont
utilisés pour la formation de l'image, les ë qui sont réémis par la
surface de l'échantillon.
A la différence du microscope électronique par transmission, il est
donc possible d'étudier des échantillons massifs dont seule la
surface est observée.

Observation d’un grain de pollen au MEB

Vidéo MEB

cours E. Grelier 56
III. Méthodes d’étude de la
composition biochimique
des cellules

1. Techniques de
fractionnement cellulaire

cours E. Grelier 57
III – Méthodes d’étude de la composition biochimique des cellules
1. Techniques de fractionnement cellulaire

Etape 1 : éclatement Pour récupérer des


de la cellule organites

Etape 2 : séparation Pour étudier les


des organites organites

cours E. Grelier 58
III – Méthodes d’étude de la composition
biochimique des cellules
1. Techniques de fractionnement cellulaire

Éclatement de la cellule
• Techniques

• physiques : ultrasons ou hautes pressions

• chimiques : choc osmotique, action de détergents ou d’enzymes

• mécaniques : pistons et cylindres comme tube de Potter

cours E. Grelier 59
III – Méthodes d’étude de la composition
biochimique des cellules
1. Techniques de fractionnement cellulaire

• L’homogénat est conservé à 0°C … Pourquoi?

Préservation maximale des structures et


. des différents constituants cellulaires
fonctions
et des enzymes

cours E. Grelier 60
III – Méthodes d’étude de la composition
biochimique des cellules
1. Techniques de fractionnement cellulaire

• Quel est le contenu de l’homogénat ?


• noyaux, mitochondries, lysosomes et peroxysomes
• fragments provenant des ruptures membranaires
(plasmique, réticulum, Golgi) se refermant
immédiatement pour donner de petites vésicules
fermées appelées microsomes

cours E. Grelier 61
III – Méthodes d’étude de la composition biochimique des cellules
1. Techniques de fractionnement cellulaire

Etape 1 : éclatement Pour récupérer des


de la cellule organites

Etape 2 : séparation Pour étudier les


des organites organites

cours E. Grelier 62
III – Méthodes d’étude de la composition
biochimique des cellules
1. Techniques de fractionnement cellulaire

 Séparation des organites par ultracentrifugation


différentielle

• série de centrifugations de plus en plus longues et donnant des


champs de gravité de plus en plus élevés pour fractionner l’extrait
initial en une série de culots et surnageants.

• technique préparative rapide, simple et permettant de manipuler


des grandes quantités de matériel sans donner cependant de
fractions parfaitement pures.

cours E. Grelier 63
III – Méthodes d’étude de la composition
biochimique des cellules
1. Techniques de fractionnement cellulaire
Séparation des organites par ultracentrifugation différentielle
Cellules vivantes Broyage Homogénat

Surnageant

Surnageant

Centrifugation
1000 g 10 min
Centrifugation
20000 g 20 min
Culot : Noyaux et débris

Centrifugation
80 000 g 60 min
Culot : mitochondries, lysosomes et peroxysomes

Culot : microsomes (membranes fragmentées)

cours E. Grelier 64
III – Méthodes d’étude de la composition
biochimique des cellules
1. Techniques de fractionnement cellulaire

 Séparation des organites par ultracentrifugation


sur gradient de densité

• gradient préformé

• gradient autoformé

cours E. Grelier 65
III – Méthodes d’étude de la composition
biochimique des cellules
1. Techniques de fractionnement cellulaire
Séparation des organites par centrifugation sur gradient de densité préformé
Protocole
 Dépôt d’une fine couche de l’homogénat à la
surface du gradient contenu dans le tube à
centrifuger : solution de saccharose ou de
glycérol dont la concentration varie de façon
régulière et décroissante du bas vers le haut du
tube, variation linéaire et continue ou bien
discontinue et par paliers.
 Centrifugation à vitesse élevée pendant
quelques heures.
 Migration des particules dans le gradient jusqu’à
une position d’équilibre qui correspond à sa Lysosomes (1,12 g/mL)
densité
 Obtention d’anneaux le long du tube Mitochondries (1,18 g/mL)
(centrifugation zonale) qui peuvent être
récupérés séparément par aspiration.
Technique Peroxysomes (1,23 g/mL)
 permettant d’obtenir une séparation des
constituants cellulaires en une seule étape
 d’un grand degré de pureté.
 ne permettant de manipuler que de petits
volumes de matériel biologique et constituant
donc une technique uniquement analytique.

cours E. Grelier 66
III – Méthodes d’étude de la composition biochimique des
cellules
1. Techniques de fractionnement cellulaire
Séparation des organites par centrifugation sur gradient de densité autoformé

 Également appelée centrifugation sur gradient de densité à l’équilibre.


• Dilution de l’homogénat dans une solution concentrée de chlorure de césium (CsCl)
• Centrifugation de cette préparation à plus de 200 000g pendant plusieurs heures.
• Sédimentation des ions Cs+ très denses
• Établissement d’un gradient de concentration (gradient de densité)
• Répartition des constituants de l’homogénat dans ce gradient selon leur densité
• Obtention d’anneaux le long du tube
• Récupération des différentes fractions.
 Cette technique permet de séparer les molécules indépendamment de leur taille et avec
des différences de densité très faibles (elle permet notamment de séparer des
fragments d’ADN ayant du N14 de ceux ayant du N15).

Technique mise au point par Svedberg (1923) pour déterminer des masse moléculaires et appliquée à la biologie par le physiologiste belge
Albert Claude (Prix Nobel 1974) pour isoler les microsomes
Détermination de Coefficient de Sédimentation exprimé en unités Svedberg S défini comme la vitesse de sédimentation (m/s) par unité
d’accélération (m/s2) et équivalent à 10-13s

cours E. Grelier 67
III – Méthodes d’étude de la composition
biochimique des cellules
1. Techniques de fractionnement cellulaire
Séparation des organites par centrifugation sur gradient de densité autoformé

3-

Densité croissante

cours E. Grelier 68
III. Méthodes d’étude de la
composition biochimique
des cellules

2. Marquage

cours E. Grelier 69
III – Méthodes d’étude de la composition
biochimique des cellules
2. Marquage

 Elastine dans le derme


(Coloration de WEIGERT -
grossissement x 400)

http://bioimage.free.fr/his_image/elastique_1_10.htm

cours E. Grelier 70
III – Méthodes d’étude de la composition
biochimique des cellules
2. Marquage

 Réticuline dans les tubules


rénaux (coloration Gordon Sweets
x 250)

http://bioimage.free.fr/his_image/fibres_de_reticuline.htm

cours E. Grelier 71
III – Méthodes d’étude de la composition
biochimique des cellules
2. Marquage

 Mucus : coupe de la muqueuse


oesophagienne (coloration PAS
x 100).

http://bioimage.free.fr/his_image/pas_glandes_muqueuses_oesophage_5.htm

cours E. Grelier 72
III – Méthodes d’étude de la composition
biochimique des cellules
2. Marquage

 bronche tertiaire avec son


épithélium cylindrique cilié et
cellules caliciformes entouré de
tissu conjonctif et de fibres
musculaires lisses

Coloration Hémalun Phloxine Safran -


Grossissement x 200

http://bioimage.free.fr/his_image/bronches_200.htm

cours E. Grelier 73
III – Méthodes d’étude de la composition
biochimique des cellules
2. Marquage

 frottis de sang d'anémie


sidéroblastique montrant un
sidéroblaste II (érythroblaste
acidophile possédant dans son
cytoplasme des grains
d'hémosidérine (molécule de
stockage du fer) car il ne peut
intégrer le fer dans
l'hémoglobine la coloration est
la coloration de Perls x 1000

http://bioimage.free.fr/hem_image/sidero8g.htm

cours E. Grelier 74
III – Méthodes d’étude de la composition
biochimique des cellules
2. Marquage

 frottis de leucémie aigue où les


blastes (cellules cancéreuses)
possèdent dans leurs
granulations de la
myéloperoxydase mise en
évidence par ajout d'un substrat
qui précipite sous forme de
grains bleus ce qui fait classer
le leucémie en LAM (leucémie
aiguë myéloblastique).

http://bioimage.free.fr/hem_image/peroxps7g.htm

cours E. Grelier 75
III – Méthodes d’étude de la composition
biochimique des cellules
2. Marquage
Marquage spécifique par des conjugués (marqueurs fixés sur des anticorps)
Fluorochromes

Isotopes radioactifs
Enzymes (peroxydase ou phosphatase alcaline)

Fuseau mitotique mis en évidence par un anticorps antitubuline


reconnu par un anticorps maqué à l’Alexa 488
Chromosome révélé en bleu par du DAPI (colorant spécifique des
bases nucléotidiques)

Ferritine Or (ou argent)


(cœur de fer opaque colloïdal
aux électrons)

Granules sécrétoires de
Glucagon mis en évidence dans
cellules gastriques mis en
des cellules pancréatiques par
évidence par un anticorps
un anticorps antiglucagon
antigastrine reconnu par un
reconnu par un conjugué (anti
conjugué (anti Ig couplé à la
Ig couplé à l’or colloïdal) MET
ferritine) MET

cours E. Grelier 76
IV. Méthode d’étude du
métabolisme cellulaire

1. Isotopes radioactifs

cours E. Grelier 77
IV. Méthode d’étude du métabolisme cellulaire
1. Isotopes les plus utilisés

• Notion d’isotopes
• éléments chimiques ayant le même nombre d’électrons que les éléments
naturels mais différant par la masse de leur noyau.
• pouvant être instables : radioactifs car subissant des désintégrations
libérant des électrons ou des radiations détectées :
• par un compteur Geiger (mesure de l’ionisation produite par les radiations dans un
gaz)
• par un compteur à scintillation (mesure d’éclairs lumineux provoqués dans un
liquide scintillant)
• par son action sur le bromure d’argent d’une émulsion photographique que les
radiations réduisent en argent métallique et qui est ensuite développée sous
forme de taches visibles.
• principaux radio-isotopes utilisés en biologie
• 3H (acides minés, oses, nucléotides)
• 14C (acides aminés, nucléotides)
• 32P (nucléotides)

• 35S (acides aminés soufrés)

• 22Na

• 42K

• 125I.

cours E. Grelier 78
IV. Méthode d’étude du
métabolisme cellulaire

2. Principe

cours E. Grelier 79
IV. Méthode d’étude du métabolisme cellulaire
2. Principe

• Pulse chase permettant d’étudier le métabolisme


cellulaire
• Pulse : mises en présence pendant une courte durée de cellules vivantes
et d’un précurseur métabolique radioactif dit chaud qui est incorporé
dans la cellule entrant dans certaines réactions métaboliques.

• Chase : maintien des cellules dans un milieu contenant un large excès de


précurseur froid et donc élimination progressive du précurseur chaud
jusqu’à ce que seule une petite quantité soit incorporé dans la cellule.

• Détection : prélèvements espacés régulièrement permettant de suivre les


transformations du précurseur chaud en diverses molécules portant le
marquage radioactif ou réalisation d’autoradiographies afin de localiser
dans quel compartiment se situent les molécules radioactives.

cours E. Grelier 80
IV. Méthode d’étude du
métabolisme cellulaire

3. Détection de la
radioactivité des
préparations biologiques :
l’autoradiographie

cours E. Grelier 81
IV. Méthode d’étude du métabolisme cellulaire
3. L’autoradiographie

Coupe de cellule
 Marquage radioactif

Noyau
Autoradiographie permettant la
localisation de composés Émulsion
photographique
radioactifs dans des cellules
entières ou des coupes de tissus.
• Exposition de cellules vivantes à
un pulse rapide d’un composé
radioactif. Atome
• Lavage, fixation puis traitement radioactif
Grain
pour l’observation en microscopie d’argent
photonique ou électronique.

Trajet des
Dépôt sur la préparation d’une électrons
mince couche d’émulsion
photographique et incubation.
• Développement de l’émulsion
• Localisation de la radioactivité par Grain d’argent
la position des grains d’argent

cours E. Grelier 82
IV. Méthode d’étude du métabolisme cellulaire
3. L’autoradiographie

Autoradiographie en microscopie
électronique d'une cellule épithéliale
provenant d’un animal auquel de la
thymidine tritiée a été administrée quatre
jours auparavant.
L’incorporation de thymidine tritiée dans le
noyau, résulte d’une synthèse d’ADN
utilisant cette base nucléotidique. Elle
signe l’apparition d’une cellule nouvellement
formée.

cours E. Grelier 83
V. Culture cellulaire

1. Conditions à respecter

cours E. Grelier 84
V. Culture cellulaire
1. Conditions à respecter

• Température régulée la plus proche possible de la température naturelle.


• pH neutre maintenu grâce à l’emploi de solutions salines tamponnées et une
atmosphère enrichie en CO2.
• Présence de nombreux éléments nutritifs : glucose, sels minéraux, acides
aminés….
• Présence de facteurs de croissance : vitamines et utilisation de sérum de
veau.
• Respect d’une asepsie stricte : ajout éventuel d’antibiotiques aux milieux
de culture.
• Support adapté en verre ou en plastique parfois recouvert de composants
de la matrice extracellulaire comme le collagène.

cours E. Grelier 85
V. Culture cellulaire

2. Intérêts des cultures


cellulaires

cours E. Grelier 86
V. Culture cellulaire
2. Intérêts des cultures cellulaires

• Étude de l’influence de différents facteurs sur


les cellules : substrats, température, substances
chimiques, médicaments…

• Suivi de précurseurs du métabolisme marqués


pour étudier leur devenir dans la cellule.

cours E. Grelier 87
V. Culture cellulaire

3. Différents types
cellulaires utilisés

cours E. Grelier 88
V. Culture cellulaire
3. Différents types cellulaires utilisés

Cellules issues de tissus normaux


• Obtention des cellules
• à partir d’organes ou de tissus d’organismes adultes ou embryonnaires
• par action chimique et mécanique sur le tissu d’origine.
• Culture primaire :
• mise en cultures dans des boîtes contenant un milieu de culture adapté d’une suspension
cellulaire ajustées
• multiplication pour former un tapis continu (confluence)
• arrêt des divisions par inhibition de contact.
• Passage donnant une culture secondaire :
• trypsination : détachement des cellules de la culture primaire du support par action de
la trypsine
• ensemencement des cellules dans un milieu nutritif neuf.
• Nombre de passage : limité sauf pour les cellules embryonnaires
• 2 ou 3 pour les cellules épithéliales,
• Un peu plus pour les fibroblastes (cellules du tissus conjonctif).
• Cellules gardant les caractéristiques des cellules du tissu d’origine

cours E. Grelier 89
V. Culture cellulaire
3. Différents types cellulaires utilisés

• Cellules de lignées continues


• propriétés :
• croissance rapide,
• perte de l’inhibition de contact,
• possibilité d’un nombre illimité de passage.
• obtention :
• sélection de cellules issues de tissus normaux ayant développé une mutation
spontanée les rendant « immortelles » comme les cellules 3T3 de rongeur.
• traitement de cellules normales par des agents chimiques ou physiques
mutagènes ou par des virus oncogènes pour les rendre « immortelles ».
• utilisation
• de cellules cancéreuses dites transformées (capables d’induire une
tumeur après injection à un animal sain) comme les cellules HeLa
(humaines, carcinome de l’utérus, utilisées depuis 1952)
• ou de cellules embryonnaires comme les cellules MRC5 (fibroblastes
pulmonaires embryonnaires humains)

cours E. Grelier 90
V. Culture cellulaire
3. Différents types cellulaires utilisés

• Cellules hybrides
• obtenues par fusion chimique ou physique et possédant,
dans un premier temps, deux noyaux séparés appelées
hétérocaryons .
• donnant après mitose des cellules hybrides dans laquelle
tous les chromosomes se rassemblent pour former un
unique noyau.
• Technique de culture des hybridomes utilisée dès 1976
pour développer la production industrielle d’anticorps
monoclonaux après formation d’un hétérocaryon entre
• Un plasmocyte (LB différencié) sécréteur d’anticorps spécifiques
• une cellule de myélome (cancer du tissu conjonctif où les cellules cancéreuses
sont de nature plasmocytaire)

cours E. Grelier 91