ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA BAHAN ALAM

Disusun Oleh : 5. Nurhayati

1. Shabrian Nurhafidzhah 6. Yulinda
2. Zelvy 7. Eka Rahmadhani
2. Nadia 8. Nuri Dwi Lestari
3. Febri Yulianti
Isolasi dan Identifikasi Senyawa Metabolit Sekunder Ekstrak
Metanol Batang Brotowali (Tinospora crispa Linn)

klasifikasi Brotowali :
Divisi : Spermatophyta
Sub Divisi : Angiospermae
Kelas : Dicotyledonea
Bangsa : Ranunculales
Suku : Menispermaceae
Marga : Tinospora
Jenis : (Tinospora crispa, L)
 Slide Title
Banyak senyawa metabolit
sekunder yang dihasilkan dari
berbagai jenis tumbuhan di
Indonesia. Adanya senyawa
tersebut, maka tumbuhan
tersebut memiliki prospek
untuk dimanfaatkan dalam
bidang pengobatan. Salah
satu tanaman obat yang
sering digunakan masyarakat
untuk pengobatan tradisional
adalah brotowali.
 Slide Title

Ekstrak batang
brotowali mengandung
senyawa tinokrisposid Pada ekstrak kental n-
yang terbukti mampu heksana batang brotowali
menekan mengandung senyawa
perkembangan bakteri antimakan atau pestisida
Plasmodium berghei nabati yaitu senyawa
dalam darah mencit golongan triterpenoid
dan memperpanjang
hidup mencit yang
terinfeksi.
 Pada ekstrak metanol brotowali dengan
uji hepatoprotektor terhadap virus hepatitis B
mampu memberikan pertolongan pada
perbaikan fungsi hati akibat penginduksian
dengan vaksin hepatitis B
hepatoprotektor dalam batang brotowali
adalah terpen, steroid, flavonoid,
glikosida dan alkaloid
pada bagian batang yang diinformasikan
memiliki banyak kandungan senyawa
metabolit sekunder yang menarik yang
belum banyak diteliti. Selain itu batang
brotowali juga mudah diperoleh
dibandingkan daun, akar dan bunga
brotowali.
hepatoprotektor dalam batang brotowali Berdasarkan uraian
tersebut, mengenai khasiat
dan kandungan kimia
brotowali maka peneliti
menganggap perlu
dilakukan penelitian lebih
lanjut dalam mengisolasi
dan mengidentifikasi
senyawa metabolit
sekunder yang terkandung
pada ekstrak metanol
batang brotowali.
 Metode Penelitian
Alat - Alat

Ekstraksi, Fraksinasi, Pemurnian dan Identifikasi

Preparasi Sampel

- Bejana maserasi - Evaporator

- Pisau - Corong biasa - Kolom kromatografi cair
- Oven vakum (KKCV)
- Blender - Corong pisah - Gelas ukur
- Corong bunchner - Hot plate
- Ayakan - Labu erlenmeyer - Pipet tetes, spektroskopi IR
- Gelas kimia - Neraca analitik
- Baskom - Chamber - Botol vial, lampu uv
- Batang pengaduk - Kolom kromatografi tekan
 Bahan - Bahan

- Metanol - Reagen pereaksi lieberman-burchard, FeCl3

- n-heksana Meyer dan Wagner
- Etil asetat - Silika gel G 60
- Kloroform - Plat KLT alumunium berlapis silika gel G 60 F254
- Aseton - Aluminium foil
- Aquadest - Kertas saring,
- Alumunium foil - CeSO4 2%
- Kertas saring - Tisu
 Prosedur Kerja
1) Ekstraksi
Batang
Brotowali

- di potong kecil-kecil
- diangin-angin tanpa matahari
4,5 kg
Brotowali halus
- di maserasi dgn metanol 3x24 jam

Ekstrak

- di pekatkan dengan evaporator

Ekstrak Kental
- di uji golongan dgn pereaksi
Metanol
Lieberman-Burchard (terpenoid & steroid)
FeCl3 (flavonoid)
Meyer (alkaloid)
Wagner (alkaloid)
 Ekstrak Kental
2) Fraksinasi Metanol
- di analisis KLT
- di fraksinasi dgn metode KKC
- dgn silika gel G 60
Hasil fraksinasi
KKCV
- di uji dgn KLT

Fraksi gabungan

- di fraksinasi dgn KKT

Fraksi yang
diperoleh
- di analisis dgn KLT
- di gabung fraksi-fraksi yang mempunyai profil noda yang sama

Fraksi gabungan

- di uapkan

Komponen padatan
 4) Identifikasi
3) Pemurnian

Isolat murni
Komponen
padatan - di uji golongan dgn pereaksi
Lieberman-Burchard, FeCl3,
- di kristalisasi atau di rekristalisasi Meyer, dan Wagner
- Kemurnian senyawa ditentukan dgn KLT
sistem tiga eluen dgn eluen n-heksana : etil Diketahui gol senyawa
asetat, n-heksana : kloroform, etil asetat : metabolit sekunder
kloroform. - di identifikasi lebih lanjut
dgn spektrofotometer
Isolat murni inframerah
Diketahui gugus
fungsi senyawa tsb
 HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil Determinasi
Berdasarkan surat keterangan yang diperoleh, menyatakan bahwa tanaman yang digunakan dalam
penelitian ini adalah Benalu Jeruk (Dendrophtoe pentandra (L.) Miq.)dari suku Loranthaceae.
Hasil Ekstraksi
proses pemekatan didapatkan berat dari masing-masing ekstrak, yaitu ekstrak n-heksan sebanyak
2,7301 gram dengan rendemen 0,27%. Ekstrak etil asetat sebanyak 5,8850 gram dengan rendemen 0,58%. Ekstrak
etanol sebanyak 21,1429 gram dengan rendemen 2,11%. Dan ekstrak air sebanyak 24,3498 gram dengan rendemen
2,43%. Kemudian masing-masing ekstrak tersebut dilakukan uji skrinning fitokimia dan uji toksisitas dengan metode
brine shrimp lethality test.
Uji Fitokimia Uji Toksisitas Metode BSLT
Tabel 1 Hasil uji fitokimia masing-masing ekstrak batang Benalu Tabel 2 Hasil uji toksisitas masing-masing ekstrak batang Benalu
Jeruk (Dendrophtoe pentandra (L.)Miq.)
Jeruk (Dendropthoe pentandra (L.) Miq)

Senyawa kimia dikatakan berpotensi aktif atau toksik bila

mempunyai nilai LC50 kurang dari 1.000 ppm

Keterangan :
(+) : terdapat senyawa metabolit sekunder
(-) : tidak terdapat senyawa metabolit sekunder
Analisis Kromatografi Lapis Tipis Ekstrak n-heksan
Pemisahan Fraksi III dengan Kromatografi Kolom II
Hasil eluasi menunjukkan bahwa eluen n-heksan – etil Tabel 5 Hasil Fraksinasi kromatografi kolom II
asetat (10:1) memberikan pola pemisahan bercak yang
lebih baik dibandingkan kloroform – metanol (10:1),
kloroform – metanol (5:1) dan kloroform – metanol (2:1)
Pemisahan dengan Kromatografi Kolom I
Uji Toksisitas Metode BSLT Hasil Kolom II
Dari hasil pemisahan ekstrak n-heksan batang Tabel 6 Nilai LC50 ekstrak n-heksan batang Benalu Jeruk hasil
Benalu Jeruk (Dendrophtoe pentandra kromatografi kolom II
(L.)Miq.)dengan kromatografi kolom pertama
diperoleh 3 fraksi

Tabel 3 Hasil Fraksinasi kromatografi kolom I

Berdasarkan hasil uji toksisitas ketiga fraksi tersebut dapat
dilihat bahwa fraksi yang paling toksik adalah Fraksi 3.2 dengan
nilai LC50 sebesar 92,197 ppm dan fraksi ini dilanjutkan untuk
proses identifikasi menggunakan Spektrofotmeter Fourier
Transform-Infra Red (FT-IR) dan Gas Chromatography-Mass
Spectroscopy(GC-MS).
Identifikasi Senyawa Kimia Ekstrak n-heksan Fraksi 3.2
a.Hasil Analisis Spektrofotometer Fourier Transform-Infra Red (FT-IR)
Gambar 1 Hasil spektrofotometer FTIR Isolat 3.2 Tabel 7 Gugus Fungsional dari hasil
identifikasi spektrofotometer FTIR
b. Hasil Analisis Kromatografi Gas-Spektrometri Massa (KG-SM)
Tabel 8 Perkiraan Senyawa yang Terdapat pada Isolat n-heksan 3.2 dengan KG-SM

Berdasarkan hasil interpretasi dari instrumen yang digunakan, dimana pada spektra FTIR diperoleh munculnya
gugus alkohol, alkana dan alkena sedangkan pada kromatogram KG-SM didapat peak ( puncak) dimana memiliki
nilai kemiripan diatas 90% menurut database willey09th.L. Perkiraan senyawa kimia hasil isolasi dari ekstrakn-
heksan adalah Stigmasterol yang termasuk senyawa steroid dan dari hasil uji fitokimia ekstrak n-heksan yang
menunjukkan adanya senyawa metabolit sekunder steroid.
Slide Title
KESIMPULAN

1. Berdasarkan hasil uji fitokimia terdapat beberapa jenis

metabolit sekunder pada masing-masing ekstrak batang
Benalu Jeruk (Dendropthoe pentandra (L.) Miq) antara lain
pada ekstrak n-heksan terdapat senyawa steroid dan
flavonoid; pada ekstrak etil asetat terdapat senyawa steroid
dan tanin; pada ekstrak etanol terdapat senyawa flavonoid,
kuinon, saponin dan tanin; dan pada ekstrak air terdapat
senyawa flavonoid dan kuinon.
2. Berdasarkan hasil uji toksisitas dengan metode Brine Shrimp
Lethality Test (BSLT) ekstrak yang paling aktif adalah ekstrak
n-heksan dengan nilai toksisitasnya adalah sebesar 256,455
ppm.

3. Berdasarkan hasil isolasi dan identifikasi ekstrak n-heksan

batang Benalu Jeruk (Dendropthoe pentandra (L.) Miq) dapat
disimpulkan bahwa senyawa kimia yang terkandung pada isolat
n-heksan 3.2 diduga sebagai senyawa Stigmasterol.
ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA KIMIA DARI EKSTRAK n-HEKSAN BATANG BENALU
TANAMAN JERUK (Dendrophtoe pentandra (L.)Miq.)

Benalu merupakan tanaman yang unik, satu sisi benalu merupakan parasit
bagi inang tempat tumbuhnya, tetapi di sisi lain benalu merupakan tanaman
yang dapat dimanfaatkan sebagai obat. Benalu pada umumnya digunakan
sebagai obat campak, obat batuk, kanker, diuretik, penghilang nyeri dan
perawatan setelah persalinan dan benalu pada jeruk nipis dimanfaatkan
sebagai ramuan obat untuk penyakit amandel.Benalu yang merupakan
tanaman parasit, ternyata juga berpotensi sebagai antikanker.
Pada masyarakat Kutai
Kartanegara benalu jeruk
(Dendrophtoe pentandra (L.)
Miq.) digunakan sebagai
obat luka luar dan untuk
membantu proses
penyembuhan kanker dengan
cara direbus dengan air
kemudian diminum untuk
membantu proses
penyembuhan kanker.
Oleh karena itu, penelitian ini dilakukan untuk mengetahui jenis
metabolit sekunder yang terkandung pada ekstrak batang
benalu jeruk dan untuk mengetahui senyawa kimia apa yang ada
di dalam batang Benalu Jeruk (Dendrophtoe pentandra (L.)
Miq.)dengan cara isolasi dan identifikasi struktur molekulnya
menggunakan Gas Chromatography-Mass Spectrometry(GC-MS)
dan Spektrofotometer Fourier Transform Infra Red (FT-IR).
Pengujian awal yaitu dilakukan uji toksisitas dengan metode
Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) terhadap semua ekstrak
batang Benalu Jeruk (Dendrophtoe pentandra (L.) Miq.) dapat
diketahui bahwa ekstrak n-heksan adalah ekstrak yang memiliki
sifat toksik sehingga ekstrak n-heksan inilah yang akan
digunakan .
 Metode Penelitian

Alat - Alat

- Corong Kaca - Labu Ukur 50 mL

- Gelas Ukur 1000 mL - Labu Ukur 5 mL
- Pipet Tetes - Rak Tabung
- Alat Rotary Evaporator - Sentrifugal
- Neraca Analitik - Pipet Mikro
- Waterbath - Spektroskopi UV-Vis
- Sonikator - Kromatografi kolom
- Spatula - FT-IR
- Tabung Reaksi - GC-MS
 Bahan - Bahan

- n-heksan - Reagen pereaksi lieberman-burchard

- Etil asetat - Reagen pereaksi dragendorf
- Etanol - FeCl3 1%
- Aquades - Serbuk Mg
- Kapas - HCl
- Vaselin - Telur Udang
- Tissue - Air Laut
- Lempeng KLT - DMSO
Prosedur Kerja

Batang Benalu
Jeruk
- di maserasi dengan n-heksan, etil
asetat, etanol dan air
- dilakukan sebanyak 6 kali

Filtrat

- di dapatkan sudah tidak berwarna lagi

Ekstrak

- di pekatkan dengan evaporator

Ekstrak - di uji skrining fitokimia dan uji toksisitas

dgn metode brine shrimp lethality test
(BSLT).
- Instrumen FT-IR
- Instrumen KG-SM
1. Ekstraksi
• Batang brotowali
o dibersihkan
o dipotong-potong kecil
o dikeringkan dengan cara diangin-anginkan pada suhu kamar selama ± 1 bulan. (Proses pengeringan
tidak dilakukan dibawah sinar matahari karena panas dari sinar matahari dikhawatirkan dapat
merusak senyawa metabolit sekunder yang ada pada batang brotowali).
o Batang brotowali yang kering dihaluskan dengan menggunakan blender dan ditapis untuk
memperoleh serbuk lebih halus tujuannya untuk memperluas permukaan dari batang brotowali.
o Serbuk halus batang brotowali sebanyak 4,5 kg dimaserasi menggunakan metanol selama 3x24 jam
untuk menarik senyawa metabolit sekunder yang ada pada batang brotowali dan volume total
metanol digunakan adalah 20 liter.
o Proses ekstraksi dilakukan dengan maserasi, karena dengan cara maserasi mudah dilakukan dan
sangat kecil kemungkinan untuk terjadi kerusakan senyawa kimia yang ada pada batang brotowali.
• Maserat
• diperoleh dari proses maserasi sebanyak 13 liter.
• disaring dengan corong Buchner dengan menggunakan kertas saring Whatman.
• dievaporasi dengan tujuan untuk menguapkan pelarutnya (metanol) sehingga diperoleh
600 mL ekstrak kental metanol. Ekstrak kental metanol diuapkan pelarutnya pada suhu
kamar sehingga di peroleh ekstrak metanol sebanyak 84 gram.
• dilakukan uji golongan terhadap ekstrak kental metanol dengan menggunakan pereaksi
Meyer, Liebermann Burchard, besi (III) klorida (FeCl3), dan Wagner untuk mengetahui
golongan senyawa metabolit sekunder yang terkandung dalam sampel. Hasil dari uji
golongan dapat dilihat pada Tabel 1.
 2. Fraksinasi
• Sebanyak 8 gram ekstrak kental metanol difraksinasi
dengan KKCV.
• Sebelum dilakukan KKCV terlebih dahulu dilakukan
KLT untuk mengetahui jenis eluen yang akan
digunakan pada saat KKCV.
• Berdasarkan hasil KLT, diperoleh bahwa eluen n-
heksana : etil asetat dengan perbandingan (6:4)
menunjukkan pola pemisahan noda yang baik.
• Proses fraksinasi dilakukan menggunakan
• fasa diam berupa silika gel G 60
• fasa garak berupa eluen yang ditingkatkan
kepolarannya secara bergradien dimulai dari n-
heksana 100%, nheksana : etil asetat sampai etil
asetat 100%. Dari hasil KKCV diperoleh sebanyak
47 fraksi.
• Selanjutnya fraksi-fraksi diidentifikasi menggunakan
KLT menggunakan eluen yang sama dengan
perbandingan (6:4).
• Fraksi-fraksi yang memiliki profi noda yang sama
digabung sehingga diperoleh fraksi gabungan
sebanyak 11 fraksi.
Fraksi J dan K
o digabung menjadi fraksi Y karena mempunyai pola noda yang sama
o diuapkan diperoleh padatan berupa kristal berwarna kuning kecoklatan dengan berat
444,2 mg.
o Isolat yang diperoleh kemudian difraksinasi lebih lanjut dengan KKT. Sebelum
dilakukan KKT terlebih dahulu dilakukan KLT untuk menentukan eluen yang akan
digunakan pada KKT. Berdasarkan hasil KLT diperoleh bahwa eluen n-heksana : etil
asetat dengan perbandingan 3:7 memiliki pemisahan yang baik.
o Sampel yang telah dimasukkan kedalam kolom kemudian dielusi dengan eluen yang
ditingkatkan kepolarannya secara bergradien dimulai dari n-heksana 100%, n-heksana :
etil asetat sampai etil asetat 100%, sehingga diperoleh sebanyak 221 fraksi. Fraksi-fraksi
yang diperoleh kemudian di KLT untuk melihat kesamaan profil nodanya.
o Fraksi gabungan Y16
• berupa padatan
• berbentuk kristal
• berwarna kuning kecoklatan
• berat 89 mg.
o Fraksi tersebut di KKT lebih lanjut untuk memperoleh isolat yang
murni.
o Fraksi gabungan Y16 dianalisis KLT untuk mendapatkan eluen
yang cocok pada KKT lebih lanjut. Eluen yang menunjukkan
kromatogram yang baik yaitu nheksana : etil asetat (2:8).
• Sampel yang telah dimasukkan kedalam kolom dielusi
dengan eluen yang ditingkatkan kepolarannya secara
bergradien dimulai dari n-heksana 100%, n-heksana : etil
asetat sampai etil asetat 100%, sehingga diperoleh sebanyak
160 fraksi. Fraksi-fraksi yang diperoleh kemudian di KLT
untuk melihat kesamaan profil nodanya.
• Fraksi-fraksi yang memiliki profil noda yang sama
digabung,sehingga diperoleh sebanyak 14 fraksi gabungan.
Selanjutnya dilakukan KLT terhadap fraksi gabungan yang
diperoleh, dan pelarut dari masing-masing fraksi dibiarkan
menguap hingga diperoleh padatan.
 3. Pemurnian
• Fraksi gabungan Y169 berupa isolat berbentuk kristal berwarna kuning dengan
berat 8,1 mg. Isolat tersebut direkristalisasi untuk memisahkan isolat dari
pengotornya. Proses rekristalisasi dilakukan dengan menggunakan pelarut yang
dapat melarutkan pengotor dari isolat yang diperoleh dan pelarut yang
digunakan adalah etil asetat. Setelah dilakukan rekristalisasi diperoleh isolat
murni berbentuk kristal berwarna putih dengan berat 1,3 mg.
• Isolat yang diperoleh diuji kemurniannya dengan metode sistem tiga eluen.
Pada metode sistem tiga eluen kemurnian isolat yang diperoleh ditandai dengan
munculnya noda tunggal pada setiap plat KLT. Adapun tiga jenis eluen yang
digunakan yaitu n-heksana : kloroform (1:9) dengan Rf 0,275; nheksana : etil
asetat (2:8) dengan Rf 0,3; dan etil asetat : kloroform (4:6) dengan Rf 0,7 dan
hasil yang diperoleh berupa noda tunggal.
 Pembahasan
• 1. Identifikasi Golongan
• Berdasarkan hasil uji kelarutannya diketahui bahwa isolat yang
diperoleh bersifat polar. Isolat murni yang diperoleh
diidentifikasi lebih lanjut dengan uji golongan dan
menggunakan spekstroskopi IR. Uji golongan dilakukan
dengan menggunakan pereaksi Wagner, Meyer, FeCl3 1%, dan
LiebermannBurchard. Hasil uji golongan dapat dilihat pada
Tabel 2.

• Hasil uji golongan yang diperoleh menunjukkan bahwa isolat

murni merupakan senyawa golongan alkaloid. Hal ini
ditunjukkan dengan reaksi positif antara isolat murni dengan
pereaksi Meyer dan Wagner yang ditandai dengan perubahan
dari bening menjadi endapan putih dan endapan coklat.
• 2. Identifikasi IR
• Identifikasi selanjutnya dilakukan dengan menggunakan spektroskopi IR Shimadzu
Prestige21 yang bertujuan untuk mengetahui gugus fungsi dari senyawa yang diperoleh.
Serapan-serapan bilangan gelombang isolat murni dan gugus fungsinya dapat dilihat pada
Tabel 3 dan ditunjukkkan pada pada Gambar 1.
• Daerah serapan dari spektrum IR menunjukkan adanya beberapa gugus fungsi.
Serapan dengan intensitas sedang dan lebar pada bilangan gelombang 3421,72 cm -
1 yang diidentifikasi adanya gugus N-H ulur. Hal ini didukung dengan adanya
serapan pada bilangan gelombang 1024,20 cm -1 ; 1072,42 cm -1 dan 1109,07 cm -
1 yang diidentifikasi adanya gugus C-N. Serapan dengan intensitas sedang hingga
lemah dan tajam pada bilangan gelombang 2872,01 cm -1 dan 2931,8 cm -1
diidentifikasi adanya gugus C-H (-CH3 dan –CH2) alifatik. Serapan dengan
intensitas lemah pada bilangan gelombang 1645,28 cm -1 yang diidentifikasi
adanya gugus C=C ulur. Serapan dengan intensitas lemah nampak pada bilangan
gelombang 798,53 cm -1 diidentifikasi adanya gugus C-H aromatik.
• Berdasarkan data spektrum IR dan uji golongan diketahui bahwa isolat fraksi Y169
ekstrak metanol batang brotowali adalah golongan senyawa alkaloid.
Slide Title
KESIMPULAN

Berdasarkan hasil penelitian diperoleh bahwa senyawa

metabolit sekunder yang terkandung dalam ekstrak metanol
batang brotowali adalah golongan alkaloid, flavonoid dan
steroid. Fraksinasi dan pemurnian ekstrak metanol di peroleh
isolat murni, berdasarkan uji golongan dengan pereaksi Wagner
dan Meyer yang menunjukkan positif senyawa golongan
alkaloid dan interpretasi data IR menunjukkan adanya gugus N–
H ulur, C–N, C–H (–CH3 dan –CH2) alifatik, C=C ulur dan C–H
aromatik.
TERIMA KASIH