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SENSIBILIDAD POR

DIFUSIÓN EN AGAR
MÉTODO KIRBY-BAUER

Lic. Benjamín Castillo Gómez


INTRODUCCION:
• La determinación de la sensibilidad a los agentes
antimicrobianos es una de las principales funciones
de un laboratorio de bacteriología.

• Esta función se vuelve de especial relevancia en


una época como la actual, en la que las resistencias
a los agentes antimicrobianos son elevadas.

• Por ello es fundamental que el laboratorio pueda


aportar la información necesaria para llevar a
término un tratamiento adecuado.
INTRODUCCION:
• El principal objetivo: Es predecir cuál será el resultado
de un tratamiento.

• En muchas ocasiones los resultados se expresan, para


un patógeno aislado y analizado, de forma cualitativa
como:
1. Sensible: en cuyo caso se supone que un
tratamiento “estándar” con aquel compuesto
producirá la curación.
2. Resistente: el antimicrobiano examinado no será
eficaz en aquella patología.
3. Intermedio: la efectividad de aquel compuesto
dependerá de su localización o de la dosificación
utilizada.
CLASIFICACION:
• Métodos cuantitativos: Son aquellos procedimientos que
permiten determinar la concentración inhibitoria mínima
(CIM). Se define CIM como la mínima concentración de
antibiótico que en un período de tiempo
predeterminado, es capaz de inhibir el crecimiento in
vitro de un inóculo bacteriano previamente
estandarizado (concentración conocida de gérmenes).
Esta puede realizarse por micro o macro dilución en
caldo, dilución en Agar o E-test (marca comercial).

• Métodos cualitativos (disco difusión) Son aquellos


procedimientos que permiten clasificar directamente a
un microorganismo como sensible, intermedio o
resistente. Este es uno de los métodos más utilizados en
la práctica diaria.
EN QUE CONSISTE?

MÉTODO DE KIRBY-
BAUER:
Utiliza discos de papel
impregnados con
antimicrobianos, los
cuales se aplican sobre
la superficie del agar,
sobre el cual se ha
sembrado una cantidad
conocida de
microorganismos.
METODO DE DIFUSION KIRBY-BAUER:
• De los medios disponibles se considera al Agar Mueller Himton, el mejor
para las pruebas de sensibilidad de rutina dado que:

1. Su fórmula es la más cercana a los criterios para un medio


reproducible.
2. Es el medio recomendado por la CLSI para realizar la prueba de
susceptibilidad Kirby-Bauer.
3. Contiene bajos niveles de Timina, Timidina, y niveles controlados de
Calcio, Magnesio y Zinc.
4. Es adecuado para el desarrollo de la mayoría de las bacterias
patógenas.

• Los doctores Bauer, Kirby, Sherris y Turck probaron minuciosamente todas


las variables involucradas en el proceso.

• En 1966, publican el método.


LA SENSIBILIDAD POR DIFUSIÓN EN AGAR (Kirby-Bauer) SOLO
ESTA ESTANDARIZADA PARA LAS SIGUIENTES BACTERIAS:
CUALQUIER OTRA
BACTERIA QUE NO
APARECE EN ESTA LISTA,
1. Todas las enterobacterias EL UNICO METODO
APROBADO PARA LA
2. Pseudominas aeruginosa y
SENSIBILIDAD ES POR
Acinetobacter spp
CONCENTRACIÓN MÍNIMA
3. Staphylococcus spp INHIBITORIA (MIC) !!!!
4. Enterococcus spp
5. Haemophylus spp
6. Neisseria gonorrhoeae Por ejemplo:

7. Streptococcus penumoniae Todos los anaerobios

8. Streptococcus spp Listeria monocytogenes

9. Vibrio cholerae Campylobacter spp

10. Neisseria meningitidis


INFLUENCIA DEL Ph: 7.2 - 7.4

• Ph ácidos: halos más pequeños


(aminoglucósidos, quinolonas, y
macrólidos).
• Ph alcalinos: halos más grandes (TET,
AMP, NIT, DOXI, AMX).
PROFUNDIDAD DEL AGAR:
4mm (25ml)

• < mL: Halos más grandes


• > mL: Halos más pequeños
DENSIDAD DEL INÓCULO:
0.5 McF=1-2x108 UFC/ml.

• <inóculo (0,5 McF):


mayor halo
• >inoculo (1McF):
menor halo
OTROS FACTORES
• Incubación con CO2 :
Sólo S. pneumoniae, H. influenzae y
N. gonorrhoeae

• Tiempo de aplicación de Discos:


• >15 minutos: halos de menor
tamaño
PROCEDIMIENTO PARA LA REALIZACION DEL
TEST DE DIFUSION POR DISCO:

-1-
• Todas las
sensibilidades deben
derivar de una sola
colonia tomada del
plato original.
Seleccionar una UFC y
pasarla a TSI,LIA y
TSA.
• Con una asa recta
selecione 1 ó 2 colonias
apartir del TSA de 18-
24 hrs de incubación.
-2-
• Ajuste la turbidez del
inóculo con solución
salina estéril al 0.9%
hasta el tubo 0.5 de la
escala Mc.Farland, por
comparación visual con
el estandar. Esta
suspensión contendrá
aproximadamente 1 a
2 x 108 UFC/ml.
-3-
• Dentro de los 15
min después de
ajustado el inóculo
siembre las placas
de M.himton con un
hisopo estéril.
• Presione el hisopo
contra las paredes
del tubo a fin de
escurrir el exceso
de inóculo.
-4-
• Inocule la superficie
seca del M. Himton por
isopado en tres
direcciones para
asegurar una completa
distribucion del
inóculo.
• Las zonas de
inhibicion seran
uniformemente
circulares y el
desarrollo confluente o
casi confluente.
-5-
• Espere de 3 a 5 min,
pero no más de 15 min,
ántes de aplicar los
discos para que el
exceso de humedad
superficial sea
absorbido.
• Los discos deben ser
aplicados con una
pinza estéril, haciendo
una ligera presion y a
una distancia no
menor de 24mm uno
del otro.
-6-

• Incubar las placas


invertidas a 35°c
dentro de los 15
min, posteriores a
que los discos
fueron aplicados.
-7-
• Después de 16 a 18
hrs de incubación
examine cada placa
y mida los
diámetros de la
zona de inhibición
los cuales deberan
ser interpretados
con las tabals
presentadas por las
CLSI.
CÓMO REALIZAR LA MEDICIÓN DEL
HALO DE INHIBICIÓN?
• Previo a las lecturas de las
(ZI) se debe asegurar que el
crecimiento del germen
haya sido el adecuado.

• El crecimiento debe ser


confluente y las ZI deben
ser uniformes y circulares.

• Sostener la placa invertida


y a unos pocos centímetros
de altura de una superficie
oscura.
• Utilizando una luz
directamente desde
arriba, mida el halo
utilizando el cáliper
y sosteniéndolo
sobre la placa.
• Para la lectura de
los MH +5%SC,
primero quite la
tapa de la placa,
luego usando luz
reflejada mida las
ZI del crecimiento y
no el halo de la
hemólisis.
Antibiograma
Doble halo de
bien realizado.
inhibición

Colonias intrahalos
COLOCACIÓN DE DISCOS:

1. El retardo en la colocación de los discos (más de 15


minutos) induce halos más pequeños.

2. No se deben mover los discos una vez que han


hecho contacto con el agar. Los antimicrobianos se
difunden inmediatamente al contacto con el agar.

3. Poner 5 discos (NO MAS DE 7) por cada placa de


100 mm y no más de 12 en las placas de 150 mm.
RECOMENDACIONES DE IMPORTANCIA:

DISCOS DE SENSIBILIAD:

1. Los discos que contienen drogas de la familia de los


betalactámicos deben mantenerse en freezer a temperaturas
menores a -20 oC.
2. Los de uso diario pueden matenerse a temperaturas entre 4-8ºC
3. Deben estar envueltos en paquetes herméticos , con desecante,
para protegerlos de la humedad.
4. Antes de ser usados se deben verificar las fechas de
vencimiento.
5. Se deben sacar del refrigerador de una 30-60 minutos antes
para que estén a temperatura ambiente al momento de usarlos.
Gracias por su atención!