AKTIVITAS SPESIFIK ENZIM

α-AMILASE
Tujuan
Menentukan aktivitas spesifik enzim α-amilase hasil isolasi dan pemurnian awal dari tempe

Prinsip
Pemutusan ikatan α-1,4 glikosidik dalam pati secara acak dari bagian dalam molekul (endoenzim)
baik kedalam amilosa maupun amilopektin
 Unit Aktivitas Enzim
1 unit aktivitas enzim α–amilase adalah aktivitas enzim yang menyebabkan terbentuknya 1
mol glukosa dari substrat amilum, permenit pada temperatur 37ºC dan pH 6,1

α – amilase
Amilum Glukosa
Glukosa

y = 0,216682 x + 0,008955
Glukosa yang terbentuk ditentukan
𝑦 −0,008955 𝑉 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑉 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 1 1 kadarnya dengan metode Nelson
Unit aktivitas = 𝑥 𝑥 𝑉 𝑎𝑛𝑎𝑙𝑖𝑡 𝑥 𝐵𝑀 𝑔𝑙𝑢𝑘𝑜𝑠𝑎 𝑥 𝑡 𝑖𝑛𝑘𝑢𝑏𝑎𝑠𝑖
0,216682 𝑉 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚 Somougy
Aktivitas Spesifik Enzim α–amilase
𝑢𝑛𝑖𝑡 𝑎𝑘𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑎𝑠 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚
A𝑘𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑎𝑠 𝑆𝑝𝑒𝑠𝑖𝑓𝑖𝑘 =
𝑚𝑖𝑙𝑖𝑔𝑟𝑎𝑚 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛

y = 0,0006 x + 0,0537
𝑦 −0,0537 1
Kadar Protein = 𝑥 𝑓𝑝 𝑥
0,0006 1000
Hasil Penentuan Unit Aktivitas
Enzim α–amilase
Aktivitas enzim
Sampel Tempe Absorbansi
(mol/mL)

Ekstrak kasar 0,038 0,062

Fraksi I 0,031 0,0471

0,0917 (tidak valid)/

Fraksi II -0,034
tidak terdeteksi
Hasil Penentuan Kadar Protein
Kadar protein
Sampel Tempe Absorbansi
(mg/mL)

Ekstrak kasar 0,195 0,2355

Fraksi I 0,187 0,222

Fraksi II 0,282 0,3805

Hasil Penentuan Aktivitas Spesifik Enzim
α–amilase
Aktivitas Spesifik
Unit Aktivitas enzim Kadar protein
Sampel Tempe Enzim α–amilase
(mol/mL) (mg/mL)
( unit /mg )
Ekstrak kasar 0,062 0,2355 0,2633
Fraksi I 0,0471 0,222 0,2122
Fraksi II 0,0917 0,3805 0,2410
 Hasil Penentuan Aktivitas Spesifik Enzim
α–amilase
Aktivitas Spesifik Kesalahan dalam
Pengenceran
Kelompok Sampel Ekstrak Kasar Fraksi I Fraksi II
(unit/mg) (unit/mg) (unit/mg) Tidak valid / tidak
1 Tempe 4,613 3,490 -14,043 terdeteksi
2 Apel -0,821 -0,057 -0,007
Aktivitas Spesifik
3 Kol 0,073 - - tertinggi
4 Jagung 0,032 0,004 0,025
5 Ubi ungu 0,010 0,013 0,002
6 Pisang 0,062 0,027 0,014
7 Tempe 0,263 0,212 0,241
8 Kentang 0,779 0,296 0,152
KESIMPULAN
1. Aktivitas spesifik enzim dari ekstrak kasar tempe adalah 0,263 unit/mg
2. Aktivitas spesifik enzim dari fraksi I tempe adalah 0.212 unit/mg
3. Aktivitas spesifik enzim dari fraksi II tempe adalah 0,24 unit/mg
SARAN
1. Metode dalam penentuan aktivitas enzim α-amylase dapat juga digunakan metode DNS
(Bernfeld, 1955) sedangkan untuk penentuan kadar proteinnya dapat digunakan metode
Biuret (Gornall et al. ,1949)
Terimakasih
 Unit Aktivitas Enzim Kadar Protein Aktivitas Spesifik Enzim
Kel Ekstrak Fraksi I Fraksi II Ekstrak Kasar Fraksi I Fraksi II Ekstrak Kasar Fraksi I Fraksi II
Kasar unit/ml unit/ml unit/ml unit/ml unit/ml unit/ml unit/ml unit/ml unit/ml

1 (tempe) 0,3483 0,3099 0,6474 0,0755 0,0888 -0,0461 4,6132 3,4899 -14,0434
2 (Apel) 0,2693 0,055 0,00864 -0,328 -0,9616 -1,211 -0,8210 -0,0572 -0,0071
3 (kol) 0,062 -0,01 -0,07 0,855 -0,08116 -1,196 0,0725 0,1232 0,0585
4 (jagung) 0,2671 0,02 0,102 8,438 4,588 4,1383 0,0317 0,0044 0,0246
5 (ubi ungu) 0,0855 0,111 0,019 8,405 8,305 8,838 0,0102 0,0134 0,0021
6 pisang) 0,739 0,243 0,091 11,93 9,105 6,438 0,0619 0,0267 0,0141
7 (tempe) 0,062 0,0471 0,0917 0,2355 0,222 0,3805 0,2633 0,2122 0,2410
8 (kentang) 0,0834 0,0727 0,064 0,107 0,2455 0,4221 0,7794 0,2961 0,1516
Lampiran
 Proses Enzimatis
 Uji aktivitas spesifik enzim α-amilase diawali dengan proses
enzimatis, yaitu dengan menambahkan larutan amilum 1% yang
berfungsi sebagai substrat dan buffer fosfat ke dalam larutan enzim
yang terdiri dari ekstrak kasar, fraksi 1 dan fraksi 2 yang didapatkan
dari isolasi dan pemurnian awal Tempe .

 Pada reaksi enzimatis diperlukan proses inkubasi, dimana pada

proses inkubasi ini terjadi kontak antara enzim α-amilase dengan
substrat dalam membentuk produk yaitu glukosa.
 Penginkubasian
Campuran dari larutan amilum,enzim dan buffer fosfat
diinkubasi pada suhu 370C karena suhu tersebut merupakan
suhu optimum aktivitas enzim α-amilase.
Jika suhu inkubasi melebihi suhu optimum maka akan
menyebabkan putusnya ikatan-ikatan yang merangkai molekul
enzim, sehingga enzim mengalami denaturasi yang
mengakibatkan aktivitas enzim menurun.
Begitu pula jika diinkubasi pada temperatur yang lebih rendah
maka aktivitas enzim α-amilase kurang optimal.
Pada proses inkubasi terjadi proses enzimatis, dimana pada
proses inkubasi ini terjadi kontak antara enzim α-amilase
dengan substrat dalam membentuk produk yaitu glukosa
dengan reaksi :

Penginkubasian
CH2OH CH2OH CH2OH CH2OH CH2OH
O O O
OH OH
OH
alfa -amilase
O OH O O + Buffer Fosfat OH OH
O OH
OH OH HO HO
OH OH OH
Amilum
Maltosa Glukosa
 Kontak antara enzim dan substrat ini terjadi pada bagian sisi
aktif enzim. Sisi aktif enzim terdiri dari asam amino seperti
asam glutamat dan asam aspartat yang urutannya berbeda-
beda tergantung dari sampel yang digunakan
Metode nelson-soumogyi
Pereaksi Somogyi merupakan pereaksi tembaga alkali yang mengandung Na2PO4 anhidrat
dengan garam K-Na-tartrat (garam Rochelle), sedangkan pereaksi Nelson mengandung amonium
molibdat H2SO4.NaHAsO4.7H2O.

Prinsip dari metode Nelson-Somougyi adalah pemanasan glukosa dengan larutan tembaga
tartrat yang bersifat alkalis dan terbentuk tembaga (I) oksida (Cu2O), yang bereaksi dengan
arsenomolibdat untuk memberikan biru molibdenum yang akan diukur absorbansinya.
Reaksi terbentuknya tembaga (I) oksida
(Cu2O)
CHO CHO
H C OH H C OH
OH C H
Cu2+ OH C H
+ Cu2O
H C OH Alkali
H C OH
H C OH H C OH
CH2OH CH2OH

Glukosa Asam D-Glukonat

 Reaksi Cu2O dengan Arsenomolibdat

Cu2O + arsenomolibdat (Mo6+)+ 4H+ 2Cu2++ arsenomolibdat (Mo5+) biru + H2O

Metode Lowry
Bertujuan untuk menentukan kadar protein dari suatu sampel.

Prinsip dari metode Lowry adalah protein bereaksi dengan reagen Folin-Ciocalteu Ciocalteu,
yang merupakan campuran natrium tungstat dan natrium molibdat dalam asam, untuk
memberikan kompleks berwarna yang serapannya dapat dibaca pada spektrofotometer visible.

Back
 Fungsi Penambahan
REAGEN C REAGEN D
Berisi campuran dari reagen A (Na2CO3 2% Berisi reagen Folin-Ciocalteu Ciocalteu, yang
dalam larutan NaOH 0,1N) dan reagen B merupakan campuran natrium tungstat dan
(CuSO4.5H2O 0.5% dalam 1% larutan K-tartrat natrium molibdat dalam asam, dan aquadest.
atau Na-tartrat).
Fungsinya adalah mengoksidasi asam amino
Reagen A berfungsi sebagai pemberi suasana tirosin dan triptofan yang memiliki gugus
alkalis pada larutan. fenolik, dan melepaskan ion molibdat dan ion
tungstat berwarna biru yang serapannya dapat
Reagen B berfungsi sebagai sumber ion Cu2+ yang dibaca pada spektrofotometer visible.
akan bereaksi dengan dua buah rantai
polipeptida menghasilkan senyawa biuret.
Senyawa biuret yang dihasilkan memiliki warna
ungu yang serapannya dapat dibaca pada
spektrofotometer visible.
Reaksi Protein dengan Reagen C
reaksi dari uji Biuret antara protein dengan reagen C, yang merupakan campuran dari reagen A
(Na2CO3 2% dalam larutan NaOH 0,1N) dan reagen B (CuSO4.5H2O 0.5% dalam 1% larutan K-
tartrat atau Na-tartrat), adalah sebagai berikut :
Reaksi fosfomolibdat dengan tirosin
reaksi antara fosfomolibdat yang terdapat pada reagen Folin-Cicocalteu (Reagen D) dengan
tirosin/triptofan adalah sebagai berikut :
Reaksi fosfotungstat dengan tirosin
reaksi antara fosfotungstat yang terdapat pada reagen Folin-Cicocalteu (Reagen D) dengan
tirosin/triptofan adalah sebagai berikut :

Back
METODE DNS
DNS merupakan senyawa aromatis yang akan bereaksi dengan gula reduksi maupun komponen pereduksi lainnya untuk
membentuk 3-amino-5-nitrosalicylic acid, suatu senyawa yang mampu menyerap dengan kuat radiasi gelombang
elektromagnetik pada 540 nm. Semakin banyak komponen pereduksi yang terdapat dalam sampel, maka akan semakin
banyak pula molekul 3-amino-5-nitrosalicylic acid yang terbentuk dan mengakibatkan serapan semakin tinggi.
Reaksi dengan DNS yang terjadi merupakan reaksi redoks pada gugus aldehid gula dan teroksidasi menjadi gugus
karboksil. Sementara itu DNS sebagai oksidator akan tereduksi membentuk 3-amino dan 5-nitrosalicylic acid. Reaksi ini
berjalan dalam suasana basa. Bila terdapat gula reduksi pada sampel, maka larutan DNS yang awalnya berwarna kuning
akan bereaksi dengan gula reduksi sehingga menimbulkan warna jingga kemerahan.

METODE BIURET
Prinsip pengujian kadar protein dengan uji biuret adalah pengukuran serapan cahaya kompleks berwarna
ungu dari protein yang bereaksi dengan pereaksi biuret. Kompleks warna yang terbentuk adalah hasil reaksi
protein dengan ion Cu2+ yang terdapat dalam pereaksi biuret dalam suasana basa.