MOLEKÜLER BİYOLOJİDE

KULLANILAN YÖNTEMLER I
DERS 2

Prof. Dr. Şule ARI

Moleküler Biyoloji ve Genetik
Bölümü
2005-2006
Ökaryotik Kromozomal DNA
İzolasyonu
 Ökaryotlardan DNA izolasyonunun zorluğu: organel
(mitokondri, kloroplast) DNA’larının varlığı

 Total hücresel DNA izolasyonu için; modifiye alkali-lizis

yöntemi kullanılır

(Alkali-lizis yöntemi: plazmit DNA’sı izolasyonu için kullanılır)

Ökaryotik Kromozomal DNA
İzolasyonu
1. Hücre zarının lizisi
2. Parçalanmamış organellerin izolasyonu
3. Boyut, yoğunluk, deterjan duyarlılık farklarına
göre nukleus ve organel DNA’larının
ayrılması
4. Organeller için;
organel zarı lizisi RNA ve proteinlerden
arındırma
(organel DNA’ları plazmit DNA’sı gibi halkasal,
kapalıdır ve izolasyonları plazmit DNA
izolasyonuna benzer)
Bitki Hücre DNA’sı izolasyonu
 İzolasyonda en önemli ayırıcı
özellik; kalın hücre çeperidir
 Çeperin parçalanması için genellikle
 Homojenizasyon
 Sıvı nitrojenle dondurup parçalama
 Bunun dışındaki aşamalar diğer
ökaryotik hücrelerden DNA izolasyonuna
benzer
Sıvı Fazdan DNA’nın Saflaştırılması
ve Konsantre edilmesi Yöntemleri

Fenol ekstraksiyonu, etanolle çöktürme:

Küçük hacimlerden (0.4 ml’den az)
1mg/ml’den az konsantrasyonlarda DNA
izolasyonu için
(çoğunlukla tercih edilen yöntem)
 İzopropanolle çöktürme:
DNA solusyonu ile eşit hacimde
kullanılarak çöktürme yapılır
Sıvı Fazdan DNA’nın Saflaştırılması
ve Konsantre edilmesi Yöntemleri
 Cam boncukla saflaştırma:
Süspansion halindeki cam boncuklar DNA, RNA
ve protein çöktürmede hızlı ve etkin
yöntemdir
 Oligonükleotidlerin ve trifosfatların etanolle
çöktürülerek uzaklaştırılması:
30 bç’den kısa oligonükleotidler ve
nükleotidlerin DNA solüsyonundan
uzaklaştırılması için amonyum asetat ile
etanol çöktürmesi (2 aşamalı) uygulanır.
Anyon Değiştirici Kromatografi
ile DNA saflaştırması

 Seçici olarak nükleik asitlere bağlanan

anyon değiştirici reçine içeren kolon
kullanılır
DNA’nın RNA, protein,
karbohidrat ve metabolitlerden
hızlı olarak ayrılması sağlanır.
Kolon dolgu
maddesi
RNA İzolasyonu
 Bakteri hücresinin %6’sı
 Memeli hücresinin %1.1’i
RNA’dır
 Total 10-15g RNA’nın

%85’i %15-20’si %1-5’i

rRNA tRNA mRNA
RNA İzolasyonu
 Gen anlatımı
 Gen anlatımının analizi
 Gen anlatımının düzenlenmesi
 İşlenme
 Klonlama
çalışmalarının önemli kısmı RNA izolasyonuna dayanır
 Klonlama çalışmalarında cDNA kitaplığının kurulması
ve kitaplıktan istenen genin izolasyonu için total
RNA’dan mRNA izolasyonu gereklidir.
RNA İzolasyonu
BAŞARILI BİR RNA İZOLASYONU,
diğer moleküllerle kontamine olmamış
ve yıkılmamış RNA’ların saflaştırılması
demektir
RNA saflaştırılmasının en güç yanı
endojen RNaz’ların RNA’yı
parçalamalarıdır !!!
Başarılı RNA İzolasyonu için;
 Kelatörler (EDTA, EGTA)
 Deterjanlar (SDS) RNaz
 Guanidium izotiosiyanat inhibitörleri
kullanılmalıdır.
CAM EŞYA İÇİN;
 DEPC (dietilpirokarbonat)’ın %0.002’lik solusyonu
 DEPC’den geçişilmiş cam eşyanın otoklavlanması
 Çok temiz çalışma koşulları

(İzolasyon sırasında da solusyonlar için %0.005’lik DEPC

kullanılır)
RNA deterjan varlığında -20oC -80oC’ da saklanır
RNA İzolasyonu
Örnek prosedür (bitki total RNA izolasyonu – Fenol yöntemi)

1) Homojenizasyon
2) Fenol-kloroform (proteinlerin uzaklaştırılması
3) NaOAc ile nükleik asitlerin çöktürülmesi
4) NaOAc ile RNA’nın çöktürülmesi
5) Polisakkaritlerin uzaklaştırılması için CsCl2 derecelenme
santrifüjlemesi
6) mRNA izolasyonu için oligo dT / poli U sefaroz ile
kromatografi
(yüksek tuz konsantrasyonunuda poliA kuyruğu bağlanır,
tuz konsantrasyonu düşürüldüğünde mRNA kolonda elde
edilir)