Ekstrak daun Polyalthia longifolia yang distandarisasi

(PLME) menghambat sel proliferasi dan

mempromosikan apoptosis: Studi anti-kanker dengan
berbagai metode mikroskopi
Pendahuluan
Selama bertahun-tahun sejumlah metode mikroskopi telah dikembangkan
untuk menilai perubahan dalam sel. Dalam penelitian ini, sifat apoptogenik dan efek
sitotoksik ekstrak metanol daun panjang P. helifolia (PLME) terhadap sel karsinoma
serviks manusia (HeLa) dipelajari menggunakan mikroskop cahaya (LM),
holografik digital mikroskop (HDM), scanning electron microscope (SEM) dan
mikroskop elektron transmisi (TEM). Nilai IC50 rata-rata dari PLME terhadap sel
HeLa yang diperoleh dengan MTT dan CyQuant assay adalah 22,00 mg / mL pada
24 jam. Kesimpulannya, PLME mampu menghasilkan morfologi ciri – ciri yang
khas dari kematian sel HeLa yang sesuai dengan apoptosis.
2. MATERIAL AND METHODS
2.1. Pengumpulan tanaman dan persiapan ekstrak
• Daun P. longifolia dikumpulkan dari berbagai daerah di Indonesia Universiti Sains Malaysia
dikonfirmasi di Herbarium dari Sekolah Ilmu Biologi, Universiti Sains Malaysia, Pulau Pinang,
Malaysia, tempat sampel disimpan (Voucher spesimen: USM / HERBARIUM / 11306).
• Daun dipotong, dicuci dengan air suling dan oven-kering pada 30oC selama 7 hari.
• Setelah kering, daun kemudian dibumi bubuk halus. Sampel 100 gram bubuk tanaman direndam
dalam 400 mL metanol di RT (23oC±2) selama 7 hari.
• filtrat dari setiap ekstraksi terkonsentrasi di bawah vakum pada evaporator berputar pada 40oC dan
ekstrak pekatnya akhirnya dituangkan ke dalam cawan Petri dan dibawa ke kekeringan pada 40oC
dalam oven.
• ekstrak yang dihasilkan disimpan di RT dalam gelap. Adapun standardisasi, kuantifikasi rutin
dilakukan menggunakan sistem LC-MS / MS.
• Jumlah rutin saat ini ditemukan menjadi 8,96 µg dalam 1000 µg daun P. Longifolia ekstrak
metanol.
2.2. Evaluasi sitotoksisitas
2.2.1. MTT assay
• PLME diuji untuk sitotoksisitas in vitro, menggunakan HeLa, MDA- MB-231, MCF-7 dan sel Vero dengan
uji MTT.
• Ekstrak tumbuhan kemudian diencerkan dalam media dengan menggunakan mikropipet dengan cara
pengenceran serial.
• Konsentrasi akhir dari ekstrak tumbuhan di setiap sumur adalah antara 100 dan 0,781 mg / mL. Setelah itu,
sel-sel kultur dipanen dengan tripsinisasi dan dikumpulkan dalam vial 50 mL.
• Setiap sampel direplikasi tiga kali untuk masing-masing HeLa, MDA-MB-231, MCF-7 dan sel Vero, diikuti
dengan inkubasi.
• Setelah perawatan, mediumnya disedot dengan hati-hati dan sel-sel dicuci dengan fosfat buffered saline
(PBS) dan diinkubasi lagi dalam medium segar dengan MTT pada 37oC.
• Endapan ungu jelas terlihat di bawah mikroskop, medium, bersama dengan MTT.
2.2.2. Tes CyQUANT
• Sel-sel itu disepuh dalam plat mikro-titer fluoresensi hitam 96 well, dengan kepadatan 5000 sel / well.
• Setelah 24 jam, rangkap tiga sumur dirawat dengan PLME dari konsentrasi 100 hingga 0,781 µg / mL secara
serial cara pengenceran. Kontrol sumur diperlakukan dengan kendaraan saja (DMSO, 0,2%).
• Setelah 24 jam perawatan pada 37oC, media adalah dibuang, dan piring dibekukan 80oC hingga digunakan.
• Pada hari analisis, lempeng dengan sel yang patuh dicairkan dan diinkubasi dengan pewarna CyQuant selama
5 menit dalam gelap.
• Fluoresensi diukur pada pembaca mikro-plat fluoresensi dengan filter, ditetapkan pada eksitasi 480 nm dan
emisi 520 nm.
• Konsentrasi IC50 dari PLME ditentukan untuk garis sel HeLa yang diuji. Setiap percobaan dilakukan secara
independen setidaknya tiga kali.
2.3. studi mikroskopi
2.3.1. Mikroskop cahaya (LM)
• Perubahan morfologi sel dilakukan dengan Giemsa sebelum observasi menggunakan mikroskop fase kontras.
• Sel dikultur pada kepadatan 1,5x105 sel / mL dan kemudian diobati dengan IC50 (22,00 µg / mL) dari PLME
untuk suatu waktu inkubasi 6, 12, 24 dan 36 jam.
• Sel HeLa yang tidak diobati digunakan sebagai kontrol. Media disedot perlahan di ujung mereka waktu inkubasi
masing-masing, dicuci dengan PBS dan diperbaiki dengan Mc-Dowell Trump yg digambarkan.
• Setelah membuang fiksatif, Giemsa noda ditambahkan.
• noda dicuci dengan air suling dan udara kering. Sel-sel kemudian diamati pada pembesaran 400x dan morfologi
difoto.
• Semua gambar itu dipilih lebih dari total 50 mikrophotograf yang ditangkap untuk masing-masing jarak waktu.
2.3.2. Mikroskop digital holografik (HDM)
• Perubahan morfologi sel diperiksa dengan tidak merusak dan mikroskopi holografik fase non invasive.
• Sel dikultur pada kepadatan 1,5x105 sel / mL semalam dalam 25 cm2 budaya labu dan kemudian diobati dengan
IC50 (22,00 mg / mL) dari PLME untuk inkubasi waktu 6, 12, 24 dan 36 jam.
• Sel HeLa yang tidak diobati digunakan sebagai kontrol. Perubahan sel diamati pada perbesaran 200x dan foto
yang diambil diambil menggunakan khusus perangkat lunak HoloStudioTM
• Semua gambar dipilih secara total 50 mikrophotograf ditangkap masing-masing untuk setiap interval waktu.

2.3.3. Memindai mikroskopi electron

• Observasi SEM dilakukan pada sel HeLa
• Sel dikultur pada kepadatan 1,5x105 sel / mL semalam dalam 25 cm2 labu kultur. Kemudia diperlakukan dengan
IC50 (22,00 mg / mL) dari PLME untuk waktu inkubasi 6, 12, 24 dan 36 jam.
• Sel HeLa yang tidak diobati digunakan sebagai kontrol.
• Sel-sel dilihat di bawah pemindaian mikroskop elektron dan dilakukan di bawah kondisi analitis: L = SE1, WD
= 21 mm, dan EHT = 10.0 kV.
• Semua gambar dipilih lebih dari total 50 microphotographs yang diambil untuk interval waktu masing-masing.
2.3.4. Mikroskop elektron transmisi
• Sel dikultur pada kepadatan 1,5x105 sel / mL semalam dalam 25 cm2 labu kultur dan diperlakukan dengan IC50
(22,00 mg / mL) dari PLME untuk waktu inkubasi 6, 12, 24 dan 36 jam.
• Pada akhir masa inkubasi, sel-sel trypsinized ditangguhkan di fixation McDowell Trump, disiapkan dalam 0,1 M
dapar fosfat selama 24 jam.
• dibilas buffer dan post-fixed selama 2 jam dalam 1% osmium tetroxide disiapkan di PBS.
• Sampel dipindahkan ke agar secara bertahap didehidrasi peningkatan konsentrasi etanol sebelum dimasukkan ke
resin.
• Resin sel HeLa dipotong menjadi sangat tipis bagian dalam proses ultramicrotomy, dan diwarnai dengan uranil
asetat dan timbal sitrat.
• pengamatan sel dilakukan di bawah TEM. Semua gambar dipilih lebih dari total 50 foto yang diambil
microphotographs masing-masing untuk setiap interval waktu.

2.3.5. Analisis statistic

Analisis regresi diplot untuk menghitung respons-respons hubungan mana artinya ± SD untuk rangkap
tiga dan nilai IC50 untuk Tes MTT dan CyQUANT dikuantifikasi menggunakan Graphpad Prisma versi 7.
3. Hasil
3.1. Efek sitotoksisitas dari PLME diukur dengan MTT dan CyQUANT
Hasil dari evaluasi sitotoksisitas PLME sebagai konsentrasi setengah penghambatan (IC50) nilai (mg / mL)
ditunjukkan pada Gambar 1. Nilai IC50 dari PLME terhadap sel HeLa adalah 15,15 mg / mL pada 24 jam
menggunakan MTT (Gambar 1a)

Dengan demikian, nilai IC50 dari PLME terhadap sel HeLa adalah 28,86 mg / mL pada 24 jam menggunakan uji
CyQuant (Gambar 1b).
 Dosis-respons yang mudah diamati dalam penghambatan pertumbuhan sel terlihat pada sel-sel leher rahim
HeLa sebagai konsentrasi PLME meningkat. Selain itu, kami juga menguji sitotoksisitas dari PLME sel kanker
lainnya menggunakan MTT uji sendiri untuk mengevaluasi efisiensi PLME pada sel kanker lainnya. Efek dari
PLME pada sel Vero direpresentasikan secara grafis (Gambar 1c) yang dievaluasi oleh MTT assay sendiri. Nilai
IC50 dari PLME pada sel Vero ditemukan menjadi 51,07 mg / mL pada 24 jam. Untuk MTT dan CyQUANT
masing-masing ditunjukkan bahwa datanya bagus sesuai dengan garis regresi untuk menentukan IC50. Semua
konsentrasi dikuantifikasi dalam rangkap tiga, n = 3.

3.2. Perubahan morfologi dievaluasi dengan mikroskop cahaya (LM)

Dampak perlakuan PLME pada sel HeLa diamati menggunakan sebuah mikroskop cahaya pada interval 6,
12, 24 dan 36 jam dan perubahan dijelaskan dengan perbesaran 100x, 200x dan 400x. Kerusakan sel karena PLME
pengobatan di IC50 22,00 mg / mL digambarkan pada Gambar 2.
 Pengamatan LM selama 6 jam PLME diperlakukan sel HeLa Giemsa bernoda menunjukkan penyusutan
sel dan blebbing (pembentukan struktur mirip balon kecil). Setelah perawatan selama 12 jam, sel HeLa bernoda
Giemsa menunjukkan sel penyusutan dan sel apoptosis. Pengamatan mikroskopis dari 24 jam PLME yang
diperlakukan sel HeLa Giemsa-bernoda menunjukkan perubahan morfologi khas apoptosis, termasuk
menyusutnya sitoplasma, lamellipodia singkat dan penggumpalan sel. morfologi sel HeLa berubah sangat baik
pada kelompok yang diterapi PLME pada 36 jam dibandingkan pada kelompok kontrol. Kesimpulannya, setelah
perawatan, lebih banyak sel muncul dalam bentuk bundar dengan warna intens saat mereka berkembang menuju
36 jam pengobatan.
3.3. Perubahan morfologi dievaluasi dengan mikroskop digital holografik (HDM)
Efek dari PLME pada sel HeLa diamati menggunakan HDM yang ditangkap pada interval 6,12, 24 dan
36 jam dan perubahannya ditampilkan dengan perbesaran 200x (Gambar 3). Sel yang tidak dirawat diatur secara
teratur dan tumbuh bersebelahan dengan poligon datar/memanjang/bentuk berlian, yang menandakan bahwa sel-
sel kebanyakan tumbuh dengan patuh dalam status yang sehat. Morfologi sel HeLa yang diterapi dengan PLME
memiliki perubahan yang jelas dalam cara tergantung waktu, terutama area sel dan ketebalan optik rata-rata, yang
menyiratkan bahwa bentuk berubah sesuai dengan durasi pengobatan PLME.
Pengamatan ini menunjukkan bahwa sel HeLa menjadi lebih sempit, lebih padat dan membentuk struktur
melingkar, yang sangat menunjukkan bahwa jumlah tubuh seperti apoptosis sangat meningkat oleh perlakuan
PLME. Namun, tidak ada variasi yang terlihat pada kelompok yang tidak diobati, yang hanya diperlakukan dengan
kendaraan saja (DMSO, 0,2%). Ini adalah pertama kalinya perubahan morfologi yang diinduksi oleh PLME telah
dilaporkan dalam sel HeLa menggunakan pencitraan HDM.
3.4. Perubahan morfologi dievaluasi dengan memindai electron mikroskop (SEM)
Efek pengobatan dari PLME pada sel HeLa diamati menggunakan SEM pada interval 6,12, 24 dan 36
jam dan perubahannya dirinci menggunakan pembesaran 300x diikuti oleh berbagai perbesaran untuk menyoroti
spesifisitas aspek tertentu. Kemajuan sel saat terpapar pada PLME ditangkap pada Gambar 4 yang memiliki ciri
morfologi khas sel kanker serviks yang melakukan pembelahan sel dengan jembatan intraseluler yang saling
menghubungkan dengan jelas. Sel yang tidak diolah menunjukkan struktur epiteloid yang sedikit diratakan yang
terdiri dari mikrostruktur dari tiga daerah sitoplasma utama — zona nuklir, juxtanuklear dan perifer.
Setelah 36 jam paparan, elektromikrograf SEM menunjukkan variasi analog morfologi yang paling
signifikan dengan karakteristik morfologi permukaan sel yang ditemukan dalam apoptosis, termasuk blebbing
membran sel dan hilangnya mikrovili dengan badan apoptosis terpisah. Sel yang rentan ditunjukkan sebagai
lingkaran dan dikelilingi oleh tubuh apoptosis di permukaan sementara sel-sel lain muncul melingkar dan melekat
di rumpun.