Técnicas de DNA Recombinante e

Ingeniería Genética

DNA Recombinante: Fusión de dos (o más) secuencias de DNA de orígenes

diferentes (por ejemplo: DNA humano + DNA de bacteria)

Ingeniería Genética: Disciplina que utiliza la tecnología del DNA recombinante

para generar organismos genéticamente modificados (transgénicos)
 DNA Recombinante
DNA organismo donante

Reinserción a la
bacteria
Gen de interés

Expresión del
gen foráneo en
la bacteria

“Minicromosoma” bacteriano Proteína

cromosoma bacteriano Recombinante

INSERTO VECTOR
 DNA Recombinante

Vector Cerrado DNA de Célula

 DNA Recombinante

Gen de Interés
(INSERTO)

Vector Abierto
 “Tijeras Moleculares” = Enzimas de Restricción
• Son enzimas que cortan en secuencias específicas en DNA de doble hebra

• Son producidas por bacterias y sirven de mecanismo de defensa contra

infecciones virales, una especie de “sistema immunológico” bacteriano

• La mayoría posee sitios de corte en secuencias PALINDRÓMICAS de DNA (que

se leen igual para ambos lados)

Ejemplo: Eco RI

5’ GAATTC 3’ 5’ G 3’ 5’ A A T T C 3’
3’ CTTAAG 5’ 3’ C T T A A 5’ 3’ G 5’
Algunas Enzimas de Restricción de Uso Común
“Pegamento Molecular” = DNA Ligasa

Necesita un extremo 5’-P para sellar la unión entre dos hebras de DNA (no
complementarias)

Ejemplo: Eco RI

GAATTC G 3’-OH P-5’ A A T T C

CTTAAG C T T A A 5’-P OH-3’ G

Extremos COHESIVOS
(“pegajosos”)

G AATTC DNA Ligasa GAATTC

CTTAA G ATP CTTAAG
“CLONAMIENTO” DE UNA SECUENCIA DE DNA
Tipos de Vectores de Clonamiento
Bacteriófago (fago) l

Plásmido o
Plasmidio

Cósmido o Cosmidio
M13 (virus)

Fagemido

BAC (bacteria YAC (yeast

l artificial artificial
chromosome) chromosome)
Construcción de una LIBRERÍA GENÓMICA

MILLONES DE FRAGMENTO
DIGERIR CON S GENÓMICOS DIFERENTES
ENZIMAS DE
RESTRICCIÓN
DNA HUMANO
INSERTAR FRAGMENTOS
EN PLASMIDIOS CON
DNA LIGASA
PLASMIDIOS
RECOMBINANTE
S
INTRODUCIR PLASMIDIOS
EN BACTERIAS

LIBRERÍA GENÓMICA
Secuenciación de DNA (Método de Sanger):
Utiliza nucleótidos no extendibles
(dideoxinucleótidos)
Figure 8-50b Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Figure 8-50c Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
 Secuenciación Manual Secuenciación Automatizada
32P-dNTP (uno de los Cada ddNTP marcado con
nucleótidos normales) un fluoróforo diferente)
 Electroferograma

Figure 8-51 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

 Colonias de bacterias o pl
Selección de una LIBRERÍA acas de fagos = CLONES

GENÓMICA (“Screening”) Colonias de bacterias

o placas de fagos

Hacer una “copia” de la placa

con papel de nitroceluosa)
LIBRERÍA GENÓMICA
Papel de nitrocelulosa

Romper bacterias o fago

s
Marcador
(32P, biotina,
digoxigenina) DNA de bacteria o fag
o unido al papel
3’ GCAATCGATCTA 5’
5’ ATTGGATCGTTAGCTAGATGGCTGTA 3’ Incubar papel con una
SONDA específica

Detectar la sonda por

diferentes medios (rad
ioactividad, colorimetr
ía)
 ¿Y si quiero un clon para expresar una proteína?
Se debe clonar la secuencia correspondiente al mRNA
Gen eucarionte:

promotor

intrones exones
transcripción
Pre-mRNA

splicing

Secuencia codificante: mRNA

traducción

proteína
Copia de RNA a DNA:
Partidor Oligo(dT)

Transcriptasa reversa sintetiza

TRANSCRIPCIÓN la primera hebra

INVERSA O REVERSA

Llevada a cabo por la

Digestión del mRNA
TRANSCRIPTASA (RNasa H)

REVERSA
(de origen viral)
DNA polimerasa sintetiza la segunda hebra
Síntesis de DNA
Complementario
DNA de
= cDNA doble hebra

Agregar “colitas” de hebra simple en los

CONSTRUCCIÓN DE extremos para poder insertar en vector
LIBRERÍAS DE cDNA

DNA de doble hebra listo para

SCREENING ETC ser insertado en un vector
 Tecnología del PCR
Polymerase Chain Reaction (Reacción en Cadena de la Polimerasa)
• Utiliza DNA polimerasas provenientes de microorganismos termófilos (que viven a
temperaturas extremadamente altas, por ejemplo, en géiseres)
• En cada ciclo se duplica la cantidad de copias de la secuencia de interés
• Elimina la necesidad de construir y seleccionar librerías
 La mezcla de reacción contiene DNA templado,
dNTPs, DNA polimerasa (termoestable) y
TERMOCICLADOR
partidores (primers).

1) DENATURACIÓN O DESNATURACIÓN
Alta temperatura (94-98ºC) para separar las he
bras del DNA templado

2) HIBRIDIZACIÓN O HIBRIDACIÓN
Temperaturas más bajas (Tipicamente
40-60ºC) para permitir la hibridación de los
partidores o “primers” en ambos extremos
de la secuencia de interés

3) EXTENSIÓN
DNA polimerasa termoestable polimeriza
desxirribonucleótidos desde los partidores a
las temperatura óptima de la enzima
(alrededor de 72ºC).
Análisis de fragmentos de DNA por Electroforesis en Geles de Agarosa
Preparación del Gel

100ºC

Fundir

Verter al molde

peineta
molde

Gelificación a
Tº ambiente
(“Cuajado”)
agarosa
Análisis de fragmentos de DNA por Electroforesis en Geles de Agarosa
Corrida electroforética
Fuente de poder

La velocidad de migración en el gel de

agarosa es inversamente proporcional
al tamaño; mientras más pequeña la
molécula, más fácilmente migrará a través
de la trama del gel
Análisis de fragmentos de DNA por Electroforesis en Geles de Agarosa
Corrida electroforética

Marcador o
“Estándar” de
tamaño: Mezcla
de framentos de
DNA o RNA de
tamaño conocido
para poder estimar
el tamaño de los
fragmentos de las
muestras
Análisis de fragmentos de DNA por Electroforesis en Geles de Agarosa
Tinción con Bromuro de Etidio y Visualización UV

Bromuro de Etidio
Se intercala entre las
bases nitrogenadas de los
ácidos nucleicos
 Algunas Aplicaciones de la Tecnología del DNA Recombinante
• Investigación Científica - Estudiar la función de genes
- Producir proteínas recombinantes
- Marcadores proteicos (ej fluorescentes)
- Organismos genéticamente modificados
(knock-out o transgénicos)

• Medicina - Insulina recombinante

- Hormona de crecimiento recombinante
- Vacunas recombinantes
- Terapia génica

• Biotecnología - Plantas modificadas genéticamente resistentes a diferentes

condiciones
- Insectos modificados genéticamente para
controlar plagas (ej mosquito resistente a Dengue)
- Bacterias modificadas genéticamente (ej para
descontaminar derrames de petróleo)
- Ganado modificado genéticamente
- Levadura modificada genéticamente para la industria cervecera
 En Investigación
Ejemplo: Proteínas fluorescentes

Bacterias
fluorescentes

Gen Proteína
fluorescente
verde (GFP)

Células
fluorescentes

Medusa Aequorea victoria

Animales
fluorescentes
 En Medicina
Ejemplo: Bacteria productora de Insulina
 En Medicina
Ejemplo: Terapia Génica Contra la Coroideremia con Vectores Virales

Coroideremia enfermedad degenerativa causada por un defecto en el gen de la proteína REP1

Progresa a ceguera total eventualmente
 En Biotecnología
Ejemplo: Arroz Dorado
 En Biotecnología
Ejemplo: Vacas transgénicas

Vacas que han sido manipuladas

para producir leche libre de
lactosa, o que contenga proteínas
de importancia médica, como
insulina, lactoferrina, interferona,
entre otros

Potencialmente vacas que

produzcan más leche o más carne,
reduciendo el impacto ambiental
de la industria ganadera
Incluso como mascotas!

Peces fluorescentes (GloFish)

La Revolución en Edición Genómica: CRISPR/Cas9