ENGENHARIA GENÉTICA E

OS VETORES UTILIZADOS
UC: Biologia Celular e Molecular II
Docente: Evguenia Bekman
Discentes: Carolina Duarte
Francisco Clemente
Maryana Tsyutsyk
Mehdi Massoum
Nassim Elhaddad
Nina Gorea
 ENGENHARIA GENÉTICA
• O objetivo é introduzir novas características num ser vivo para
aumentar a sua utilidade
• Estas técnicas foram desenvolvidas a partir dos anos 70, utilizando-
se a técnica do DNA recombinante, que tem tido um enorme
impacto na evolução do conhecimento de todas as áreas de
investigação biológica
• A Engenharia Genética é útil em questões como a deteção e
terapia de doenças genéticas ou a utilização de organismos
geneticamente modificados
CLONAGEM

• A clonagem é uma metodologia

desenvolvida antes do PCR
• Tem como objetivo a produção de
grandes quantidades de um
fragmento de DNA de modo a
permitir o seu estudo e análise
• Pode ser definida como a produção
de indivíduos geneticamente iguais
por reprodução assexuada, como
foi o caso da ovelha Dolly
PASSOS:
1. O gene (fragmento de DNA exógeno) é ligado a um vetor, formando
uma molécula de DNA recombinante. Esta molécula é introduzida
numa célula hospedeira e o vetor vai funcionar como veículo que
transporta o gene para o dentro da célula, que normalmente é uma
bactéria, embora células eucariotas também possam ser utilizadas.
2. A molécula de DNA recombinante permanece na célula hospedeira
numa forma não integrada, passando a fazer parte do genoma do
hospedeiro. O vetor multiplica-se autonomamente, em paralelo com
as outras moléculas de DNA do genoma, produzindo-se numerosas
cópias idênticas de si próprio e do gene que transporta.
3. Quando a célula hospedeira se divide, as células-filhas recebem a
uma cópia idêntica do DNA genómico e também uma cópia do vetor
recombinante, formando-se clones de células iguais.
4. Após um grande número de divisões celulares, é produzido uma
colónia, ou clone de células idênticas. Cada clone contém uma ou
mais cópias de molécula de DNA recombinante exógeno. A molécula
recombinante que o transporta designa-se gene clonado.
 VETOR
• O vetor é uma molécula de ácido nucleico onde é inserido a molécula
de DNA exógeno que contem o gene que se pretende clonar
• Atualmente existe uma enorme variedade de vetores para utilização em
diversas células hospedeiras e com variadas finalidades
• Existem vetores com várias origens de replicação, os vetores shuttle, o que
lhes permite multiplicarem-se em diferentes tios de células procariotas.
• De um modo geral, um vetor tem:

 Uma origem de replicação

 Locais de restrição únicos
 Marcas de seleção
 PLASMÍDEOS
• Os plasmídeos são pequenas moléculas de DNA circulares
e de dupla cadeia, são auto-replicativas e
extracromossómicas.
1 2

1-Cromossoma bacteriano
2- Plasmídeo
REPLICAÇÃO

Replicação semi- conservativa

Indispensável a existência de sequências ORI

 MCS
• Pequena região de DNA que possui sequências de reconhecimento
únicas para um grande número de endonucleases de restrição.

• Quanto maior a variabilidade do local de clonagem múltipla maior a

flexibilidade de utilização dos plasmídeos.
 CONTROLO DO Nº DE CÓPIAS
• Plasmídeos ‘’ stringent ‘’ – baixo número de cópias

• Plasmídeos ‘’ relaxed’’ – elevado número de cópias

• Os plasmídeos ‘’ relaxed ‘’ possibilitam um maior rendimento, sendo

por isso mais utilizados na clonagem
 O QUE DEVE TER UM PLASMÍDEO PARA SER
UM BOM VETOR?

• Baixo peso molecular

• Apresentar estabilidade
• Apresentar um grande número
de cópias
• Sequências ORI
• MCS ou polylinker
• Presença de marcas seletivas fenotípicas
Em relação as marcas seletivas
fenotípicas…

• Seleção negativa: inativação de um gene por

inserção;

• Seleção positiva: Seleção de transformantes que

contêm o plasmídeo recombinante
 FAGO
• Vírus que infeta e se multiplica em bactérias;

• A sua reprodução depende de células hospedeiras;

• Necessita de bactérias metabolicamente ativas para se multiplicar;

• É constituído por ácido núcleico, utilizando uma ou várias moléculas de DNA ou

RNA, em cadeia simples ou dupla.
TIPOS DE FAGO
• Consoante as suas características morfológicas, existem dois tipos de
fagos

Icosaédricos com cauda Filamentosos

PROCESSOS QUE ASSEGURAM A
MULTIPLICAÇÃO FÁGICA:
• Proteção por parte da cápsula;
• Correta inserção do ácido núcleico no interior da bactéria;
• Correto funcionamento dos processos intracelulares que levam à formação
de novos fagos.
ESTRATÉGIAS DE MULTIPLICAÇÃO
Primeira fase:
-Consiste na ligação
extracelular do fago
á bactéria

Segunda fase:
-Entrada e
replicação do
DNA viral

Terceira fase:
-Libertação
dos fagos por
lise celular
 ESTRATÉGIAS DE MULTIPLICAÇÃO
• Fagos virulentos: Infeção através do processo do ciclo lítico;
• Fagos temperados: Infeção através do ciclo lisogénico.

Fago M13 Fago Lambda

 Adsorção
Entrada do ácido nucleico

Ciclo Lítico

Lise

Replicação

Montagem
CICLO LISOGÊNICO
A Lisogenia, ou o ciclo lisogénico, é um dos ciclos de reprodução viral.

Ciclo Lítico ou Ciclo Lisogénico

Este é o estado em que uma célula cujo genoma foi infetado por um vírus bacteriófago.
Os fagos que se replicam apenas através do ciclo lítico são conhecidos como fagos virulentos,
enquanto que os fagos que se multiplicam usando ciclos líticos e ciclos lisogénicos, são
conhecidos como fagos temperados.
1) DNA fágico injetado na bactéria-Transcrição
para síntese de um repressor-DNA fágico
inserido no DNA bacteriano- profago.
2) A bactéria agora designada lisogénica
cresce e multiplica-se;
3) O DNA fágico contem genes que codificam
uma proteína que impede a transcrição dos
genes fágicos necessários para o ciclo lítico.

NOTA: Se essas proteínas não se produzirem o

DNA fágico é removido e segue-se o ciclo lítico.
CICLO PSEUDO-LISOGÉNICO
• DNA fágico na forma circular;
• DNA fágico não se integra no genoma
bacteriano;
FAGOS Λ
 FAGOS DE CLONAGEM

Inserção •DNA com máx. 15 Kb

•DNA com 0-25Kb

substituição •Parte do genoma removida
VANTAGENS DOS FAGOS COMO VETORES
• A eficiência da clonagem, tal como a eficiência da infeção com fagos λ é
muito superior, graças à possibilidade de inserir e empacotar o DNA dos
fagos in vitro.
• O número de clones que pode ser obtido com plasmídeos é limitado pela
ineficiência de transformação das E.coli e pelo pequeno número de
colónias que podem ser detetadas numa caixa de Petri típica.
• Os fagos como vetores permitem a clonagem de maiores fragmentos de
DNA em relação aos plasmídeos.
 COSMÍDEOS
• Híbridos resultantes da união de um local cos do fago λ com plasmídeos;
• Locais de restrição-genes de resistência a antibióticos;
• Sequência de DNA do fago λ-empacotamento do DNA;
• DNA misto, cabeça e cauda fágicas.
• 4-6 Kb
• Fragmentos de DNA de 30 até 50 Kb.
 VANTAGENS DOS COSMÍDEOS
• Podem ser clonados grandes
fragmentos de DNA e de maneira mais
eficaz visto que com os fagos e os
plasmídeos é difícil obter um bom
resultado introduzindo grandes
fragmentos de DNA.
• Elevada eficiência de transformação e
de penetração nas células.
FIM
 BIBLIOGRAFIA
• http://www.biorede.pt/page.asp?id=1207
• https://pt.khanacademy.org/science/biology/biology-of-viruses/virus-
biology/a/bacteriophages
• https://seconline.egasmoniz.edu.pt/moodle/pluginfile.php?file=%2F21999%2
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%20de%20BCM2%20MIMD%202018.pdf
• https://www.sobiologia.com.br/conteudos/Seresvivos/Ciencias/biovirus2.ph
p
• https://imperiodelaciencia.files.wordpress.com/2012/09/ciclo-
lc3adtico2.png
• Google Imagens.