LMA – Diagnóstico laboratorial

Nydia S. Bacal
LMA – OMS

Leucemia Promielocítica Aguda

LMA M3 clássica
LMA M3 variante
 Classificação da OMS
Categoria Freqüência
L.M.A. com anormalidades genéticas recorrentes
LMA com t(8;21)(q22;q22)/ AML1-ETO 5-12%
LMA com inv(16)(p13q22) ou t(16;16)(p13;q22)/ CBF/MYH11 10-12%
LMA com t(15;17)(q22;q12)/ PML-RAR 5-8%
LMA com anormalidades do 11q23 / MLL 5-6%
LMA com displasia de múltiplas linhagens
Pós-SMD ou doença mieloproliferativa Variável
Sem antecedentes Variável
LMA/SMD associada a tratamento
LMA/SMD associada com agentes alquilantes Variável
LMA/SMD associada com inibidores da topoisomerase II Variável
LMA não categorizada nos itens anteriores
LMA com mínima diferenciação 5%
LMA sem maturação 10%
LMA com maturação 30-45%
Leucemia mielomonocitária aguda 15-25%
Leucemia monoblástica e monocitária aguda 3-6%
Leucemia eritróide aguda 5-6%
Leucemia megacariocitária aguda 3-5%
Leucemia basofílica aguda Rara
Pan-mielose com mielofibrose aguda Rara
Sarcoma mielóide Rara
 LMA 99P - LMA12

normal inv(16)

t(8;21)

D835

11q23
bcr-abl
flt3 dek-can

Robin Foá – Atibaia 03/2007

Vanderson Rocha – Board Review-MDAnderson/HIAE/ Junho 2007
 LMA não categorizada
• > 60% dos casos de LMA
• Base para classificação é a morfologia, grau de maturação
e citoquímica
• Não existem anormalidades citogenéticas recorrentes
• O critério diagnóstico é ≥20% de blastos na MO (em 500
células) ou SP (200 leucócitos)
• Se houver leucopenia acentuada pode se fazer esfregaços
do buffy coat
• Biópsia de MO é necessária para o diagnóstico de
leucemia aguda hipocelular em S.P. e M.O.
• Recomendações para classificação são aplicáveis apenas
em amostras obtidas antes da quimioterapia.
 IMUNOFENOTIPAGEM
• Fundamental para o diagnóstico de:
• LMA-M0
• LMA-M7

• Pode ser importante no diagnóstico de:

LMA-M6b (Leucemia eritróide pura)
• LMA-M3 (hipogranular)
 Diagnóstico Laboratorial
LMA e LPA – LMA M3
• Diagnóstico na rotina
PML-RARα qualitativo PCR e FISH – HIAE
PML-RARα quantitativo - Nichols– 72horas(s/ estabilidade)
FLT3 qualitativo – Nichols
NPM – Exon 12 – Nichols
C-Kit – qualitativo – Nichols – 72horas(s/ estabilidade)
CBFβ MHY11 (inv 16) – Quali/quantitativo– Nichols – 72horas(s/ estabilidade)
FISH – envio de células
AML1-ETO (t:8;21) – Quali e quantitativo – Nichols – 72horas(s/ estabilidade)
FISH – HIAE
MLL PTD 11q23 - FISH – HIAE
Não Disponíveis: t(11;17) PLZF-RARα/NuMA- RARα/ t(5;17)NPM-RARα/
t(17;17)STSTSb-RARα
CEBPα ; BAALC ; ERG ; NRAS ;

• Valor Prognóstico e Futuro

Forma Clássica - LPA - LMAM3

Faggot Cells

Dr. Eduardo Rego – Atibaia 03/2007

Forma Variante LPA - M3v
S. P.
Forma Variante LPA - M3v
MO

Citoquímica para MPO – deve ser fortemente positiva

Dr. Eduardo Rego – Atibaia 03/2007
Forma Hiperbasofílica

Dr. Eduardo Rego – Atibaia 03/2007

 Diferenciação Granulocítica – MO normal
Painéis de anticorpos monoclonais

II II
II III
III IV
IV VV

Mieloblasto Pro- Mielócito Meta- Neutrófilo

mielócito mielócito
Bastão
CD34
CD117 CD117
HLA-DR
CD13+forte CD13+forte CD13+fraco CD13+ CD13+forte
CD33+forte CD33+forte CD33+fraco CD33+fraco CD33+fraco
CD15 CD15 CD15 CD15
CD11b CD11b CD11b+forte
CD16 CD16+forte

CD34/CD117/CD45/CD13.33

CD16/CD13/CD45/CD11b
Dra. Maria Silvia – Florianópolis Santa Catarina
Imunofenotipagem

0
10 1
10 2
10 3
10
CD13 PE ->
FJL.002

Dr. Eduardo Rego – Atibaia 03/20

 LMA M3

CD45xSS CD2xCD45

HLA-DRxCD45 CD34xCD45 MPO(c)xCD45 CD56xCD45

CD33xCD45 CD13xCD45 CD117xCD45 CD71xCD45

 IMUNOFENOTIPAGEM
• Antígenos mielomonocíticos (CD13, CD15 e CD33) e
ausência de expressão de antígenos monocíticos
(CD14, incluindo My4, Leu M3 e Mo2) e ausência de
HLA-DR

• Estudos iniciais - ausência de CD34 e CD7,mas

Edward et al (1999) observaram que 41% dos casos
de LPA com CD34 (+).

• HLA-DR (+) em LPA e HLA-DR (-) em LMA com

morfologia não M3

Dr. Alberto Orfao – Universidade de Salamanca

 LMA - TRIAGEM FENOTÍPICA DE
ALTERAÇÕES GENÉTICAS

t(8;21) MPO+, CD13, CD33, CD19+, CD56+

Comumente LMA-M2

t(15;17) MPO+, CD13+ heterogêneo, CD33++

homogêneo, CD15-, CD34-, HLA-DR-
LMA Promielocítica – FAB M3

Hurwitz, CA et al, Blood, 80: 3182, 1992 Orfao, A et al, Haematologica, 84:405, 1999
• 111 casos de LMA de novo
• 38 morfologia de M3 (34 morfologia típica e 4 M3v)

• PML-RARα - 39 dos 111 (35%)

• 34 morfologias M3 e 5 casos foram classificados

como M0 (2 casos), M1(1 caso) e M2 (2 casos)
 ORFAO et al
• Quatro grupos conforme

Morfologia / genética molecular

1) M3 / PML- RARα + (n=34)

2) Não-M3 / PLM-RARα + (n=5)

3) M3 com PML- RARα - (n=4)

4) Não-M3 / PML- RARα – (n=68)

 ORFAO et al
• CD33 homogêneo nas células blásticas em 82% dos casos

• CD13 em todas as células leucêmicas com padrão heterogêneo de

expressão (100%)

• Expressão de CD34/CD15 (100%)

• Discriminação entre M3/PLM-RARα (+) e M3/PLM-RARα (-) :

‫ ٭‬padrão fenotípico CD34/CD15

‫ ٭‬expressão de CD13

‫ ٭‬presença de subtipo maior de células blásticas.

 ORFAO et al

• A sensibilidade da imunofenotipagem para selecionar

casos PLM-RARα foi de 100% e especificidade 99%

• HLA-DR negativo é provavelmente o achado mais

específico ( 91%)
 Expressão e quantificação do CD33 em LMA / LPA
80% Blasti CD33+
APL N O molecole CD33/cell = 23017

0 256 512 768 1024 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4

FSC-Height -> CD33 PE ->
Spalice R. MO 14/11/02.003 Spalice R. MO 14/11/02.003

AML M4 80% Blasti CD33 +

NO molecole CD33/cell =1648

0 256 512 768 1024 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4

FSC-Height ->
Petriconi R. MO 30/12/02.003 FL3-H ->
Petriconi R. MO 30/12/02.003

70% Blasti CD34+ CD33+

AML M2 NO molecole CD33/cell = 2992

0 256 512 768 1024 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4

FSC-Height -> CD34 FITC -> Robin Foá – Atibaia – 03/2007
 LEUCEMIA PROMIELOCÍTICA AGUDA (LPA)

 LPA é caracterizada por uma translocação específica

t(15;17)

 t(15;17) envolve o gene receptor do ácido retinóico

RAR-alpha no cromossomo 17 e o gene PML, um fator
de transcripção, no cromossomo 15,
gerando o gene quimérico PML-RAR-alpha

 o resultado da proteina quimérica PML/RARα é

crucial para a patogênese da LPA

Dr. Zago – Atibaia 03/2007

 SLD de acordo com o grupo de risco citogenético-
Median: molecular
Standard: 3.2 years (C.I. 95%: 38,6 - 60,6)
Intermediate: 1.6 years (C.I. 95%: 36,9 - 63,1)
High: 0.62 years (C.I. 95%: 39,2 - 59,7)

standard-risk: median DFS = 3.2 years

intermediate-risk: median DFS = 1.6 years

high-risk: median DFS = 0.62 years

p<0.0001

years from CR

standard: 85 events 47
intermediate: 56 events 34 Mancini et al, Blood 2005
high: 91 events 75
 Translocações Cromossômicas
Envolvendo o Gene RARα

Translocação Gene de Fusão Morfologia Resposta ao

ATRA
t(15;17)(q22;q12) PML-RAR Clássica ou Sensível
microgranular
t(11;17)(q23;q21) PLZF-RAR Assoc. Resistente
microgranular
t(11;17)(q13;q21) NuMA-RAR Clássica Sensível
t(5;17)(q23;q12) NPM-RAR Clássica ou Sensível
microgranular
t(17;17) STAT5b- RAR Resistente

Genes X
Genes X-RAR
Dr. Eduardo Rego – Atibaia 03/2007
 MÉTODOS DIAGNÓSTICOS
Estrut. Alvo Método T Vantagem Desvantagem
Cromosso t(15;17) Cariótipo 13-14 Específico Crescimento em cultura; fusões
mos dias crípticas não são detectadas,
não define alvo para MRD

FISH 2-3 Céls. intérfase Custo, não define alvo para

dias MRD

DNA genes PML e Southern 7 dias Específico Laborioso, uso de radioativos,

RARα não define alvo para MRD

RNA fusão RT-PCR 1 dia Rápido, Qualidade do RNA, falsos

PML/RARa sensível, define positivos
alvo p/ MRD

Núcleo Proteína PML Imunofluores. 1 dia Rápido, barato Artefatos, não define alvo para
MRD

Dr. Eduardo Rego – Atibaia 03/2007

Imunofluorescência anti-PML
PML RAR

RA

PML RXR RAR

5’ DR5 3’

LMA – não LPMa

Dr. Eduardo Rego – Atibaia 03/2007
 Acute Myeloid Leukemia
Tyrosine Kinase Receptor Mutations

Gene Mutation Frequency

FLT-3 Duplication 15-30%

Point Mutation 5-10%

FMS Point Mutation 10-20%

c-KIT Various <10%

Vanderson Rocha – Board Review-MDAnderson/HIAE/ Junho 2007
 Core Binding Factor AML
Prognostic impact of TK receptor mutations
1.0
0.8
E F S (%)

0.6 FLT3 wildtype

0.4
0.2
p<0.001 FLT3 mutation
1 2 3 4 5 6
years

Robin Foá – Atibaia – 03/2007

 Core Binding Factor AML
Prognostic impact of TK receptor mutations
1.0
0.8
E F S (%)

0.6 FLT3 wildtype

0.4
0.2
p<0.001 FLT3 mutation
1 2 3 4 5 6
years
1.0
0.8
O S (%)

0.6
c-KIT wildtype
0.4
0.2
p=0.03 c-KIT mutation

1 2 3 4 5 6
years Robin Foá – Atibaia – 03/2007
LMA. Carcaterísticas clínicas de acordo com o
status FLT3
FLT3 pos FLT3 neg

Pts 150 (20%) 582

Idade(mediana) 15-60 (48.5) 16-60 (40.5)

Sexo F/M 86/64 290/292

G.B.(mediana) 10.1-410 (126.0) 1.0-170 (28.2)

Blastos (%) 50-100 (85) 12-98 (46)

Robin Foá – Atibaia – 03/2007

Robin Foá – Atibaia – 03/2007
 NPM
1 Kb Exon 12

1 2 3 4 5 6 78 9 10 11 12

Oligomerization MB Ac NLS Ac NLS Heterodimerization

Mutations
None (wild type) GATCTCTG....GCAGT....GGAGGAAGTCTCTTTAAGAAAATAG
Mutation A (77%) GATCTCTGTCTGGCAGT....GGAGGAAGTCTCTTTAAGAAAATAG
Mutation B (13%) GATCTCTGCATGGCAGT....GGAGGAAGTCTCTTTAAGAAAATAG
Mutation C (2%) GATCTCTGCGTGGCAGT....GGAGGAAGTCTCTTTAAGAAAATAG
Mutation D (2%) GATCTCTGCCTGGCAGT....GGAGGAAGTCTCTTTAAGAAAATAG
Mutation E (2%) GATCTCTG....GCAGTCTCTTGCCCAAGTCTCTTTAAGAAAATAG
Mutation F (2%) GATCTCTG....GCAGTCCCTGGAGAAAGTCTCTTTAAGAAAATAG

Pelo menos 40 variantes da mutação NPM já foram identificadas

Falini et al., NEJM 352: 254-266, 2005

 NIH 3T3
NPM MUTANTS LOCALIZE ABERRANTLY IN THE CYTOPLASM

NPM wild-type NPM-mutated

GFP GFP
C
NPMm NPMwt

86

47
WT Mutated

WB: anti-NPM (376)

Robin Foá – Atibaia – 03/2007

 Tratamento: Fatores Prognósticos
• Pacientes idosos (>60 anos ? ; >80 anos)
• Sanz et al (PETHEMA+GIMEMA)
– Baixo risco: GB<10.000/μl e Plt>40.000/ μl
– Alto risco: GB≥10.000/ μ l
– Risco intermediário:GB<10.000/ μl e Plt<40.000/ μl
• Persistência do PML/RARα pós-consolidação
• Mau prognóstico mas não modificam o tratamento:
CD56+, isoforma S do PML/RARα e mutações do
FLT3
• Não são fatores de mau prognóstico: anormalidades
citogenéticas adicionais (30%)

Dr. Eduardo Rego – Atibaia 03/2007

 GIMEMA-AIEOP “AIDA” Trial
Risco de recaída de acordo com
monitoramento precoce de RT-PCR após
consolidação
1
RT-PCR positive
0.8
Probability

0.6
p=0.0001
0.4

0.2
RT-PCR negative
0
0 12 24 36 48
Months

Robin Foá – Atibaia – 03/2007

 Sobrevida da LPA em pacientes
tratados por recaída hematológica vs
molecular
1.0
Molecular
0.8

0.6

0.4 Hematologico

0.2
P = 0.01
0.0
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0

32 20 7 2
94 47 26 14

Robin Foá – Atibaia 03/2007

Expressões gênicas em LMA: grupos moleculares e
resultados

Clear correlation between cytogentic groups 54 AML pediatric samples with a different signature
and gene expression (Kohlmann, 2003, Genes, that is associated with outcome (Yagi, 2003, Blood)
Chrom Cancer)

Identification of a HOX signature in samples

with normal cytogenetics (Debernardi, 2003,
Genes, Chrom Cancer) Robin Foá – Atibaia – 03/2007
Vanderson Rocha – Board Review-MDAnderson/HIAE/ Junho 2007
 AmpliChip Leukemia
MILE: Clinical Objectives
Objective 1:
Clinical accuracy of the microarray test as compared to
standard leukemia laboratory methods (“gold standard”)
n = 4000 patients

Gold standard Microarray-based gene

Diagnostic Information expression profile

Morphology Cytogenetics Immunophenotyping

Cytochemistry FISH PCR

Robin Foá – Atibaia – 03/2007

 AmpliChip Leukemia
The “MILE” multi-center pre-
marketing study

Microarray Innovations in LEukemia

A retrospective and prospective study to

compare laboratory standard leukemia
tests with a new microarray-based gene
expression test

Robin Foá – Atibaia – 03/2007

 AmpliChip Leukemia
Key hematological centers participating in Phase-I
The MILE study will be conducted in collaboration with the
European Leukemia Network plus US participants

European Leukemia Network (WP13)

Principal Investigator: T. Haferlach

• Site 1 Montpellier / France

• Site 2 Munich / Germany
• Site 3 Berlin / Germany
• Site 4 Rome / Italy
• Site 5 Padua / Italy
• Site 6 Salamanca / Spain
• Site 7 Cardiff / UK

US Sites – Memphis, La Jolla

Robin Foá – Atibaia – 03/2007

 Classification performance of 17 - class
algorithm: MDS not included in data set
Class Name N Sensitivity Specificity
C1 mature B-ALL with t(8;14) 18 0.833 1.000
C2 Pro-B-ALL with t(11q23)/MLL 101 1.000 0.999
C3 c-ALL/Pre-B-ALL with t(9;22) 127 0.934 0.999
C4 T-ALL 152 0.974 0.998
C5 ALL with t(12;21) 61 0.934 0.997
C6 ALL with t(1;19) 44 1.000 1.000 Accuracy by cross-validation:
C7 ALL with hyperdiploid karyotype 50 0.853 0.997
C8 c-ALL/Pre-B-ALL without t(9;22) 188 0.871 0.991
C9
C10
AML with t(8;21)
AML with t(15;17)
72
72
1.000
0.986
1.000
0.999
95.65%
C11 AML with inv(16)/t(16;16) 73 1.000 1.000
C12 AML with t(11q23)/MLL 82 0.855 0.997
AML with normal karyotype + other - based on 30fold CV
C13 abnormalities 685 0.962 0.984
- HG-U133 Plus 2.0
C14 AML complex aberrant karyotype 144 0.887 0.997 - 2,647 samples for training
C15 CLL 455 0.996 0.999
C16 CML 151 0.984 1.000
C18 None of the above 172 0.972 0.994
2647

Robin Foá – Atibaia – 03/2007

AmpliChip Leukemia Test
MILES Stage I data presented at ASH conference
2006
[852] An International Multi-Center Microarray
Study for the Molecular Classification of
Leukemia Identifies Novel Sub-Groupings in
MDS Overlapping with AML.

Session Type: Oral Session

Authors: Ken I. Mills, Torsten Haferlach, Jesus M.
Hernandez, Wolf-Karsten Hofmann, Alexander Kohlmann,
Mickey Williams, Lothar Wieczorek

Date/Time: Tuesday, December 12, 2006 - 8:45 AM

Session Info: Simultaneous Session: Myelodysplastic

Syndromes: Molecular Biology (8:00 AM-10:00 AM)

Robin Foá – Atibaia – 03/2007

Illumina
 Core Binding Factor
Genes Proteins

 Subunity
(direct contact with DNA)

AML-1 CBF
(21q22)

 Subunity
(promotes interaction with DNA)

CBF
 Core Binding Factor
Genes Proteins

 Subunity
(direct contact with DNA)

AML-1 rhd
(21q22)
Runt homology domain (RUNX1)

 Subunity
(promotes interaction with DNA)

CBF CBF
(16p13)
 Core Binding Factor Translocations
in AML
MYH11
CBF CBF-MHY11
inv (16)
CBF
rhd
rhd

Wild type
CBF
AML1-ETO
rhd ETO
t(8;21)
 5-12% AML
8 t(8;21) 21
LEUCEMIAS MIELÓIDES AGUDAS – 912 casos analisados
MDS – 59 casos / BIFENOTÍPICAS – 10 casos no HIAE
5.139 CASOS DE DOENÇAS ONCOHEMATOLÓGICAS
(Novembro 1991 a Julho 2006)

LMA M0 65
LMA M1 154
LMA M2 135
LMA M3 120
LMA M4 149
LMA M5 61
LMA M6 17
LMA M7 16
LMA (com expressão aberrrante) 47
LMA Indiferenciada 4
LMA 144
TOTAL (17,7%) 912
LEUCEMIA (Bifenotípica) (0,19%) 10
MIELODISPLASIA (1,15%) 59
OBRIGADA PELA ATENÇÃO !
Nydia

nsbacal@einstein.br

Grupo de Citometria de Fluxo do

Laboratório Clínico HIAE - 2007

Ana Claudia Miranda Brito

Alexandra Cavalcante
Sonia Tsukasa Nozawa
Ruth Hissae Kanayama
 Diferenciação Monocítica – MO normal
Painéis de anticorpos monoclonais
I II III IV

Monoblasto Promonócito Monócito Macrófago

CD34
CD117 CD117
HLA-DR HLA-DR HLA-DR HLA-DR
CD13+forte CD13+forte CD13+forte CD13+
CD33+forte CD33+forte CD33+forte CD33+
CD11b CD11b CD11b
CD15 CD15+fraco
CD14 CD14 CD14

CD34/CD117/CD45/CD13.33

CD14/CD33/CD45/CD34
Dra. Silvia – Florianópolis Santa Catarina