TEMA 13

Métodos manuales y automatizados

para la identificación microbiana
Tema 13. Métodos manuales y automatizados para la identificación microbiana

1. Esquema general de identificación microbiana

2. Métodos convencionales
1. Pruebas bioquímicas
3. Métodos rápidos
1. Sistemas manuales
1. Enterotubo
1. Lectura e interpretación de los resultados
2. API
1. Lectura e interpretación de los resultados
2. Diferentes tipos de galeríasAPI
3. Sistema ATB (API automatizado)
2. Sistemas automatizados
1. Abac-Abactor II
1. Procedimiento
2. Vitek
1. Procedimiento
1. Esquema general de identificación microbiana
Microscopio (fresco/tinciones)
Pruebas inmunológicas Muestra
Pruebas genéticas

Aislamiento
(medios selectivos)

Microscopio (fresco/tinciones)
Pruebas inmunológicas
Cultivo puro
Pruebas genéticas
Pruebas bioquímicas

Identificación
2. Métodos convencionales

1. Pruebas bioquímicas

Rápidas (algunas) catalasa, oxidasa

- enzimas preformadas

- inmediatas

Lentas (la mayoría)

- cultivo del microorganismo (18 a 24 horas)

- medios con sustrato a metabolizar

- reacción positiva cambios de color (pH, reactivos)

Cambios de color por pH
Cambios de color por reactivos

 +
3. Métodos rápidos

Pruebas bioquímicas convencionales

• Ayuda inestimable en identificación de bacterias

Sistemas comerciales de identificación

• Manuales

• Automatizados

Ventajas:

• Rapidez de manipulación

• Homogeneidad de resultados (comparación entre laboratorios)

• Disposición de bases de datos (interpretar resultados)

3.1. Sistemas manuales

1880: primeros cultivos de microorganismos en medio sólido (Robert Koch)

1914: comercialización de un medio deshidratado (Difco)

1960-1970: sistemas comerciales (Enterotubo y API 20E)

Primeros sistemas diseñados para enterobacterias

• Frecuencia en muestras clínicas

• Rápido crecimiento

• Buen conocimiento de identificación (pruebas bioquímicas)

3.1. Sistemas manuales

Comercialización de pruebas metabólicas en paneles o galerías miniaturizados

• Gran adelanto en identificación de bacterias (principalmente)

Características:

• Pocillos de plástico

• Mínima cantidad de medio o de sustrato (liofilizado o desecado)

• Inoculación directa del medio (rehidratación del sustrato)

• Entre 10 y 50 pruebas

• Manipulación y lectura siguiendo instrucciones del fabricante

• Posibilidad de identificar enterobacterias, bacilos Gram negativos no

fermentadores, estafilococos, estreptococos, neiserias, corineformes,
bacterias anaerobias y levaduras
3.1. Sistemas manuales

Ventajas

• Fiabilidad semejante a pruebas convencionales

• Iguales entre sí

• Ocupan poco espacio (incubación y almacenamiento)

• Larga duración (caducidad: 6-12 meses)

• Manejo sencillo

• Fácil inoculación

• Fácil interpretación de resultados

• Pruebas y medios uniformes

3.1.1. Enterotubo

Becton Dickinson Diagnostics

Tubo de polipropileno (forma de lápiz)

12 compartimentos

12 medios de cultivo diferentes (pruebas bioquímicas)

15 resultados posibles
3.1.1. Enterotubo

Alambre para inoculación

Centro del tubo
atravesado por alambre
Compartimentos
Alambre sobresale por los
extremos (tapones de rosca)

No se necesita suspensión
bacteriana

Inoculación directa desde

colonias aisladas (alambre)
3.1.1. Enterotubo
Insertar alambre en los 4 primeros compartimentos (condiciones anaerobias)

Romper el resto (colocar tapones de rosca)

Agujerear 8 compartimentos restantes (condiciones aerobias)

Incubar horizontalmente 18 a 24 horas a 37ºC

Reactivos inyectados con aguja hipodérmica (a través del tubo de propileno)

1. Lectura e interpretación de los resultados

Lectura de las pruebas: positivas (1), negativas (0)

Obtención de un número binario (100100111001010)

Agrupar las pruebas de tres en tres

- negativas (todas valen 0)

- positivas

 primera del triplete vale 4

 segunda vale 2
 tercera vale 1

Obtención del número de biotipo (5 dígitos)

Comprobar identificación con ENCISE (Enterobacteriaceae Numerical Coding

and Identification System) (registro de perfiles)
3.1.2. API

Biomerieux

Suministradas en sobres de aluminio sellados

Bandeja de plástico y tapa transparentes

3.1.2. API

Tiras de plástico con 20 minitubos

Orificio en parte superior (inoculación)

Contienen sustratos deshidratados de 20 pruebas bioquímicas

Los pocillos de la bandeja se llenan con agua de grifo (mantener la humedad)

Necesaria suspensión bacteriana

• A partir de colonias aisladas

• Agua destilada o solución salina estéril (NaCl al 0,85%)

3.1.2. API
Llenado de los tubos en
la galería API 20E

Aceite de
parafina

Cúpula

Tubo Nivel de
llenado
Suspensión bacteriana estándar

Aceite de parafina

Para evitar la formación

de burbujas de aire al
llenar los tubos, dejar
resbalar la suspensión
por la pared del tubo
3.1.2.1. Lectura e interpretación de los resultados

Pruebas de lectura directa e indirecta (necesitan adición de reactivos)

Identificación de pruebas positivas y negativas por el color

API 20E
Pruebas negativas

Pruebas positivas
API STAPH

API 20 STREP
3.1.2.1. Lectura e interpretación de los resultados

Interpretación de resultados en función de tabla

Asignar el valor + ó – a cada prueba (positiva o negativa)

3.1.2.1. Lectura e interpretación de los resultados

Agrupar las pruebas de tres en tres

• Negativas (todas valen 0)

• Positivas

 Primera del triplete vale 1

 Segunda vale 2
 Tercera vale 4

Conversión del código binario (+ – +) en código octal (de 0 a 7)

3.1.2.1. Lectura e interpretación de los resultados

Transformación de las 20 pruebas en código de 7 dígitos (número de biotipo)

… etc. Pruebas no incluidas en la galería

Klebsiella pneumoniae
Código de la muestra: 5215773 o Serratia liquefaciens
3.1.2.1. Lectura e interpretación de los resultados

Anotar resultados en tarjeta

Comprobar identificación en manual o en base de datos (ordenador)

3.1.2.2. Diferentes tipos de galerías API
API 20 NE (No fermentadores)

API 20 A(Anaerobios)
3.1.2.2. Diferentes tipos de galerías API
API 50 CH

API CORYNE

API LISTERIA

API CANDIDA API NH

3.1.2.3. Sistema ATB (API automatizado)
2. Sistemas automatizados

1. Abac – Abactor II

Menarini Diagnostics
Conjunto de rotores (Abac)

Instrumento para
distribución del inóculo y
lectura de las pruebas
(Abactor)
2. Sistemas automatizados

1. Abac – Abactor II

Ssistema semi-automatizado e informatizado

Permite:

1. Identificación de bacterias Gram negativas

• Determinación simultánea de sensibilidad a 15 antibióticos

• Basado en técnicas de dilución en medio líquido

2. Determinación de sensibilidad bacteriana frente a 16 antibióticos

• Bacterias Gram negativas, Gram negativas urinarias, estafilococos

y estreptococos

3. Determinación de la CMI
3.2.1. Abac – Abactor II

Abac

Rotores con medio de cultivo deshidratado

Identificación bacteriana

Estudio automatizado de la sensibilidad antimicrobiana

• Abac-Identibiograma II: rotores que incluyen 13 pruebas bioquímicas y 15

antibióticos a una concentración única o doble
• Abac-Antibiograma: rotores que incluyen 16 antibióticos a doble
concentración
• Abac-CMI: rotores que incluyen aminoglucósidos y beta-lactámicos

Suministrados en bolsas de aluminio al vacío

Conservación hasta 18 meses (temperatura ambiente)

3.2.1. Abac – Abactor II

Abactor II

Distribución automática del inóculo

• Inoculación: 8 mL de suspensión en cavidad central de rotor

Lectura de los rotores de forma automática

Interpretación de resultados e impresión en tarjeta

• Resultados de identificación bacteriana

o Interpretación
- Exacta
- Probable
- Imposible

• Pruebas de sensibilidad
Descripción de Abactor II

Sector destinado a la distribución automática del

inóculo y la homogeneización del cultivo después de
la incubación (mediante breve centrifugación)

Sector que realiza la lectura de los Teclado para introducción del

rotores (fuente de luz enfocada por número de identificación de las
una lente al centro del pocillo) muestras y teclas de función
3.2.1.1. Procedimiento

1. Realizar suspensión bacteriana 2. Verter 8 mL del inóculo en

a partir de colonias aisladas la cavidad central delAbac

3. Colocar el rotor en Abactor para

que la rotación del aparato durante
unos segundos transfiera 0,1 mL
de inóculo a cada célula 4. Incubar el Abac en recipiente adecuado
en la estufa a 37ºC de 18 a 20 horas

5. Colocar el rotor de nuevo en Abactor, esperar

y retirar la tarjeta con los resultados impresos
Tarjeta de lectura
Mismo color que etiqueta colocada en los rotores
Formada por tres hojas autocopiables diferentes
Tarjeta de lectura

Primera hoja para microbiólogo

• Resultados de pruebas bioquímicas

• Nombre (probable o exacto) de bacteria

• Posibles pruebas adicionales (confirmar identificaciones probables)

• Perfil de sensibilidad a antimicrobianos (resistente, intermedio, sensible)

Otras copias para médico

• Identificación definitiva

• Perfil de sensibilidad
3.2.2. Vitek

Sistema automatizado e informatizado

Permite identificación de bacterias Gram negativas y Gram positivas incluyendo

patógenos de orina, patógenos entéricos, levaduras, anaerobios, Neisseria y
Haemophilus
Incubador y lector
Módulo de llenado y sellado Tarjetas
Indica susceptibilidad
Programa
a antimicrobianos

Disco duro
Impresora

Biomerieux
3.2.2. Vitek

Tarjetas de plástico transparente

Pocillo con
sustrato Llenado por succión al vacío (hasta 10
a la vez)

Transferencia automática del inóculo

Módulo de lectura admite 30, 60, 120

ó 240 tarjetas

Solicitud de resultados en cualquier

momento del proceso

Identificación disponible en 4-6 horas

de media (2 horas para bacterias de crecimiento rápido)
3.2.2.1. Procedimiento

1. Marcar la tarjeta con número que

sistema pueda leer directamente

2. Añadir diluyente al tubo que

contiene la muestra y colocar tarjetas
en soporte con el tubo de transferencia
dentro del tubo de muestra

3. Colocar tarjetas en el módulo de

llenado y sellado; la muestra se
introduce por succión al vacío en los
pocillos, sellando después la tarjeta
3.2.2.1. Procedimiento

4. Colocar tarjetas en bandeja

e introducir en módulo
de incubación y lectura

5. Posibilidad de solicitar informe

preliminar una hora después
de cargar la muestra

6. Para cada tarjeta se imprime

automáticamente al final del
ciclo un informe final