Universidad de San Martin de Porres

Facultad de medicina humana

SEMINARIO N° 10 (III-2) SEMANA Nº 13

TÉCNICAS EN BIOLOGÍA MOLECULAR,
APLICACIÓN EN MEDICINA
 INTRODUCCIÓN
• El diagnóstico es una etapa crítica en el manejo de un paciente, que
implica decisiones médicas que definirán el progreso del cuidado de
un individuo. Es una área dinámica en constante desarrollo que ha
revolucionado el diagnóstico clínico. La detección y cuantificación
específica de material genético en una muestra biológica ha
mostrado un significativo impacto en todas las áreas de la salud,
sobre todo en las áreas de las enfermedades infecciosas y el cáncer.
El desarrollo de nuevas tecnologías, más rápidas y precisas, ha
transformado al diagnóstico molecular en una herramienta clave
para el equipo clínico en directo beneficio del paciente.
• Hoy en día, el laboratorio de biología molecular es el área
diagnóstica de mayor dinamismo y crecimiento dentro los
laboratorios clínicos, revolucionando el sistema de salud, liderando
la investigación biomédica y optimizando los tratamientos médicos.
Estructura del ADN
• El ADN está constituido por una doble
cadena de ácido desoxirribonucleico,
enrollada sobre sí misma en forma de
doble hélice.
• Cada hebra de ADN está compuesta
por la secuencia variable de cuatro
nucleótidos distintos (adenina [A],
timina [T], guanina [GJ y citosina [C]).
La secuencia de nucleótidos de una
hebra determina la de la otra, ya que
cada una de estas cuatro bases
nitrogenadas se une de forma
específica sólo con otra base
nitrogenada determinada (pares de
bases). Así, las adeninas de una
cadena se unen (mediante enlaces
puentes de hidrógeno) sólo con las
timinas de la otra cadena (y las
guaninas de una cadena sólo con las
citosinas de la otra). Este
apareamiento específico de los
nucleótidos se denomina
complementariedad.
 ¿Qué es un gen ?
Un gen es una secuencia (trozo) de ADN que codifica una
proteína determinada. Todas nuestras células somáticas
poseen los mismos cromosomas y, por tanto, la misma
secuencia de ADN (genes). Es decir, todas nuestras células
poseen el mismo potencial genético. Sin embargo, no
todos estos genes están activados (expresados)
simultáneamente en todas las células. La expresión de
diferentes genes en diferentes células y, en la misma
célula, la expresión de diferentes genes a lo largo del
tiempo, concede a nuestro organismo una plasticidad
extraordinaria y una gran capacidad de adaptación. Al
mismo tiempo, sin embargo, esta extraordinaria
complejidad genética nos hace muy vulnerables al error.
De hecho, se producen errores constantemente. Gracias a
un complejo sistema de reparación genética, generalmente
estos errores no tienen mayores consecuencias. Sin
embargo, cuando el número de errores es muy elevado y/o
los sistemas de reparación fallan, se produce la
enfermedad (por ej., cáncer)
transcripción
• https://youtu.be/qOA25GbUkdA
Traducción y síntesis de
proteínas
• https://www.youtube.com/watch?v=YoyFpumWtHo
TECNICAS
1.ENZIMAS DE RESTRICCION
• O endonucleasa de restricción
• Es aquella que puede reconocer una secuencia característica
de nucleótidos dentro de una molécula de ADN y cortar el ADN en ese
punto en concreto, llamado sitio o diana de restricción.
• Los sitios de restricción cuentan con entre cuatro y seis pares de bases,
con las que son reconocidos.
• Restricción: Este sistema le permite a la bacteria protegerse de DNA
exógenos para evitar la “promiscuidad” en los intercambios genéticos.

Existen, en general, 3 sistemas de enzimas de restricción:

• Tipo 1: Una sola enzima (con 3 subunidades) tiene actividad de
restricción (corta) y modificación (metila).
• Tipo 2: Solo tienen actividad de restricción. Otras enzimas llevan a cabo
la metilación.
• Tipo 3: Se utiliza una enzima oligomérica que realiza todas las
actividades enzimáticas. Tienen función de restricción y modificación.
Cortan de 25 a 27 pares de bases lejos del sitio de reconocimiento,
dejando extremos cohesivos.
• Hay otros sistemas de restricción descubiertos actualmente, como el
sistema tipo 4 de E. coli (Eco571)
2. HIBRIDACION SOUTHERN Y
NORTHEN BLOT
• Las técnicas Southern blot y Northern blot se utilizan
para separar y caracterizar ADN y ARN respectivamente.
• La técnica de Southern fue desarrollada por Edwin
Southern para separar ADN
• la separación de ARN se denominó Northern .
• El Southern Blot, que detecta la presencia de ciertas
secuencias en el ADN, se usa, por ejemplo, para
estudiar mutaciones en el genoma.
• El Northern, en cambio, permite detectar qué genes son
transcriptos en determinadas condiciones.
SOUTHERN BLOT
• Permite detectar la presencia de una secuencia de ADN en una mezcla
compleja de este ácido nucleico. Para ello, emplea la técnica de
electroforesis en gel de agarosa con el fin de separar los fragmentos de
ADN de acuerdo a su longitud y, después, una transferencia a una
membrana en la cual se efectúa la hibridación de la sonda.
• Su nombre procede del apellido de su inventor, un biólogo inglés llamado
Edwin Southern.

• Los pasos para Southern blot:

• 1. Extracción del ADN:.

• 2. Digestión del ADN con una endonucleasa de restricción.
• 3. Electroforesis en gel de agarosa
• 4. Preparación de un ensayo de Southern ("Southern blot")
• 5. Hibridación con sonda radioactiva
• 6. Detección de los RFLPs mediante autorradiografía.
• 7. Reensayar el resultado del Southern con sondas adicionales.
NORTHERN BLOT
• Permite detectar RNA en vez de DNA (Innis y Gelfand, 1990).

• Consiste en extraer el RNA de las células pertinentes y su

posterior separación por tamaño mediante electroforesis en
gel.

• Permite conocer el tamaño preciso de un mRNA, luego del

empalme transcripcional. Además, sirve para identificar
diferentes tipos de mRNA codificados por un mismo gen y
para determinar la cantidad y el tejido específico (o tipo de
células) en que se encuentra un mRNA específico.

• Así, será posible determinar los niveles de actividad génica,

por ejemplo durante el desarrollo, o bien en distintos tejidos (o
tipos celulares) durante un período definido dela vida, o
después de haber sido sometido a los organismos a diferentes
estímulos fisiológicos
3.HIBRIDACION IN SITU
• La técnica consiste en preparar cortas secuencias de DNA de
una sola hebra, llamadas sondas, que son complementarias de
las secuencias de DNA que se quieren marcar y examinar.
• Es muy utilizada en la detección de anomalías cromosómicas.
• alta sensibilidad y especificidad
• Detecta anomalías: Aneuploidía, la pérdida de una región
cromosómica, un cromosoma entero o para monitorizar la
progresión de una aberración.
• En el diagnóstico de una enfermedad genética.
• FISH se puede aplicar a la investigación como: el mapeo de
genes, identificación de nuevos oncogenes que contribuyen a
diversos tipos de cáncer.
4. WESTERN BLOT
• O inmunoblot, es una técnica analítica usada para detectar
proteínas específicas en una muestra determinada (una
mezcla compleja de proteínas, como un extracto tisular).
• Se utiliza para determinar la presencia y cantidad de antígenos
y de anticuerpos específicos.
• En la actualidad el Western blot es el estudio confirmatorio
más empleado para el diagnóstico del SIDA. Se emplean
antígenos virales obtenidos por cultivo celular.
CUESTIONARIO
3 Explique la técnica de ELISA (Enzyme-
LinkedInmunoSorbentAssay) indirecto y sus aplicaciones en
medicina.

• Las placas ELISA se preparan de una forma idéntica a la

anterior. Los controles positivos y negativos son los mismos. El
sistema de detección emplea dos anticuerpos : uno primario
contra el antígeno, y uno secundario marcado contra el
primario. La detección tiene mayor sensibilidad por presentar
una amplificación de señal debida a la unión de dos o más
anticuerpo secundarios por cada primario. Es el ensayo más
popular, como lo es la inmunofluorescencia indirecta, pues un
mismo secundario marcado y un mismo sistema enzimático
permite cuantificar una gran cantidad de antígenos.
Etapas de ELISA
• Fijación al soporte insoluble de antígenos específicos para los anticuerpos objeto de
estudio. Lavado para eliminar los antígenos fijados deficientemente o no fijados.
• Adición del suero problema, de tal forma que sus anticuerpos reaccionarán
específicamente con los antígenos fijados al soporte. Lavado para eliminar los
anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
• Adición de anti-anticuerpos conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con los
anticuerpos específicos añadidos en el paso anterior y que se encuentran fijados a los
antígenos. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan
reaccionado.
• Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se
puede parar la reacción si se desea.
• Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado.
APLICACIONES CLINICAS
• Diagnósticos de infecciones por microorganismos: al detectar la
presencia de antígenos del agente infeccioso.
• Confirmación de la presencia de anticuerpos: pueden ser anticuerpos
contra cualquier microorganismo, inclusive vacunas, auto anticuerpos,
etc.
• Cuantificación de metabolitos: hormonas., medicamentos, etc.
4.Explique la técnica de
microarrays y sus aplicaciones
en medicina. ¿Qué es el
microrrays?
• Los microarrays de ADN, también denominados chips de ADN,
son una técnica que se emplea para comparar la expresión
génica diferencial bajo dos condiciones distintas, como puede
ser comparar la expresión génica en células normales con
células cancerígenas. Se basa en la capacidad de hibridación
entre moléculas de ADN complementarias entre sí.