BIORREMEDIACIN DE

HIDROCARBUROS CON
MICROORGANISMOS ANTRTICOS

Variacin de ln UFCs en pruebas

experimentales a diferentes
temperaturas
 ANTECEDENTES
Derrame de OCP en el 2003, en la laguna de
Papallacta.
Trabajos de remediacin mal ejecutados.
Juicio EMAAPQ- Ecuavital
Declaratoria de pasivo ambiental.
Participacin en la XIV Misin Cientfica a la
Antrtida 2010
 OBJETIVOS
Aislar e identificar microorganismos
antrticos con capacidad para degradar
hidrocarburos.
Ejecutar pruebas de biorremediacin en
laboratorio e in situ (en La Estacin Cientfica
Pedro Vicente Maldonado)
Estudio de dinmica poblacional y de
variacin de ln Ufc
 ETAPAS

Bsqueda y Pruebas de Estudio Obtencin de

aislamiento biorremediacin comparativo hbridos

Misiones Microorganismos
antrticas andinos Banco de cepas

En Ecuador, En Maldonado in
cuarto fro situ
Recuperacin de
Microorganismos Papallacta
Nueve cepas antrticos
microbianas
En Ecuador,
Papallacta Identificacin
molecular
 MATERIALES Y MTODOS
Pruebas de laboratorio
Siembra por diluciones en agar nutritivo, agar
sangre, agar chocolate y PDA.
El medio de identificacin fue un medio sinttico
con sales minerales y una fuente de carbono de
hidrocarburos, sugerido por Eriksson, 2002.
Los nutrientes del suelo (C, N, P) se evaluaron
mediante el uso de los mtodos propuestos por
Cleveland y Liptzin., (2007).
 MATERIALES Y MTODOS
La metodologa de tratamiento empleada fue
la de terrario, en bandejas de plstico de
20kg (un total de 10).
A los suelos se adicion crudo de 18 grados
API disueltos en acetona, en tal forma que los
20 kg de suelos estriles adquieran una
concentracin de 5000ppm en TPHs y 850
ppm en HAPs, conforme al anlisis inicial de
la composicin del crudo empleado.
 MATERIALES Y MTODOS
En cada una de las celdas experimentales,
excepto la testigo, los microorganismos se
adicionaron con la solucin nutritiva a razn
de 15ml/kg, por tres ocasiones; al inicio a los
30, y 60 das.
 MATERIALES Y MTODOS
Pruebas de campo
Se seleccionaron seis bandejas de plstico,
impermeabilizarlas con ayuda de lminas de
polietileno. En cada una de ellas se
depositaron 20 kg de suelo de las
inmediaciones de la Estacin Maldonado.
 MATERIALES Y MTODOS
Los microorganismos se inocularon a razn
de 15ml/kg de suelo, en cada una de las
celdas experimentales. Los suelos fueron
contaminados con 15000 ppm de TPHs,
(diesel, y gasolina) y con 5000 ppm HAPs,
(benceno).
 MICROORGANISMOS
EMPLEADOS
CDIGO REINO FILO ORDEN FAMILIA GNERO ESPECIE

BM7 Bacteria Proteobacteria Pseudomonadales Pseudomonadaceae Pseudomonas Pseudomonas sp

BM6 Bacteria Actinobacteria Actinomycetales Nocardiaceae Rhodococcus Rhodococcus sp

MM2 Bacteria Proteobacteria Pseudomonadales Pseudomonadaceae Pseudomonas Pseudomona putida

PM5 Bacteria Fermicutes Bacillales Bacillaceae Bacillus Bacillus sp

MM1 Bacteria Fermicutes Clostridiales Clostridiceae Clostridium Clostridium

perfrigens
BM6 Bacteria Actinobacteria Actinomycetales Micrococcaceae Micrococcus Micrococcus
antarticus
PM5 Bacteria Proteobacteria Sphingomonadales Sphingomonadaceae Sphingomonas Sphingomonas sp
MUESTREO Y SIEMBRA
Puesta del experimento 2012
Verificacin 2013
 Metodologa de anlisis ln Ufc a 4C,
15C por diluciones y por siembras
directas

Toma de muestras de alcuotas de las celdas

en tratamiento.
Siembras directas y conteo en placa.
Cultivo a 4C y a 15C
Uso de medio AN
 RESULTADOS
LABORATORIO ECUADOR
Durante nuestro trabajo su comportamiento
fue irregular, logrando en la mayora de las
celdas un crecimiento moderado. Los valores
variaron entre 0,08x106 de Micrococcus
antarticus y 3,7x106 de Rhodococcus sp. La
tabla No.1, ilustra el comportamiento de ste
parmetro durante las pruebas en cada una
de las celdas experimentales.
 Variacin de ln en laboratorio- Ecuador

Cepa microbiana Unidad Exp ln 1 ln 2 ln 3 ln 4 ln 5

Pseudomonas sp U1 3,40 11,28 13,14 11,40 13,56

Rhodococcus sp U2 3,04 13,91 14,40 14,77 15,12

Pseudomona putida U3 3,21 13,45 12,89 13,59 13,76

Bacillus sp U4 2,70 10,81 13,71 13,45 13,81

Clostridium perfrigens U5 2,19 10,30 12,20 13,12 13,64

Aspergillum niger U6 3,71 13,59 13,73 14,15 14,34

Penicillum Chrysogenum U7 4,14 13,45 13,73 13,91 13,99

Micrococcus antarticus U8 1,79 9,90 10,59 10,81 11,28

Sphingomonas sp U9 2,48 10,30 11,28 13,41 13,78

Testigo UT 1,09 1,09 1,60 1,94 1,79

 RESULTADOS
De la tabla se deduce que la especie
Rhodococcus presento una mayor variacin
de ln Ufc, que signific una elevada tasa de
degradacin de hidrocarburos, especialmente
aromticos, de igual forma en Bacillus sp y
Pseudomona ptida (Gualoto., 2011).
 RESULTADOS
La tendencia de ln Ufc, bajo estas condiciones es al
incremento, lo que en la prctica se traduce en un
incremento en la biodegradacin de hidrocarburos
(Gualoto., 2011).
El nmero de microorganismos degradadores de
hidrocarburos en suelos vrgenes polares a menudo
est bajo los lmites de deteccin, mientras que 105
degradadores de hidrocarburos g-1 se han detectado
en los suelos contaminados en las aguas superficiales
y capas subsuperficiales (Rike et al 2002). Tomando en
consideracin dicha fuente, estimamos que nuestros
resultados, confirman dicha abundancia
 Variacin de ln en pruebas
de laboratorio
Variacin de ln UFCs comparativo
16
Variacin de ln UFCs comparativo
16.00 14

14.00 12

12.00 10
U6

UFCs x10 6
U7
10.00 8
U1 U8
UFC x10 6

U2 U9
8.00 6
U3 UT
U4
6.00 4
U5

4.00 2

2.00 0
1 2 3 4 5

0.00
1 2 3 4 5
 Variacin de ln, in situ PEVIMA

MUESTREO
Hidrocarburo CELDA
ln 1 ln 2 ln 3

PBR-1-G 3,46 2,48 2,30

1 Gasolina
PBR-R-1-G 2,39 2,70 2,70

PBR-2-D 3,63 2,83 2,30

2 Diesel
PBR-R-2-D 3,09 3,78 2,89

PBR-3-B 4,21 3,85 3,33

3 Benceno
PBR-R-3-B 0,00 4,55 2,99

4 TESTIGO 2,56 3,55 2,48

 Variacin de ln en pruebas
de campo
ln de Ufc vs celda
5

4.5

3.5
celda 1
3 celda 1.1
celda 2
ln fc

2.5
celda 2.1
celda 3
2
celda 3.1
1.5 testigo

0.5

0
1 2 3
 RESULTADOS
Debido a lo limitado del tiempo real
disponible para el control del proceso de
biorremediacin en la Estacin Maldonado,
el nmero de controles de Ufc, es menor que
en las pruebas de biorremediacin en
Ecuador y en un perodo menor de tiempo.
Para Ecuador fueron 120 das y para la
Antrtida apenas 21 das.
 RESULTADOS
Adicionalmente las celdas experimentales no
recibieron fuentes adicionales de carbono ni
de N y P, considerando que estos son
naturalmente escasos en la Antrtida y que
bajo estas condiciones se desarrollarn los
futuros trabajos de biorremediacin in situ
(Kevin M. et al., 2013).
 RESULTADOS
Otra diferencia sustancial entre las pruebas es, el uso
de hidrocarburos de bajo peso molecular en vez de
crudo, debido a la imposibilidad de transportar crudo
a la estacin, razn por lo que se emplearon los
hidrocarburos presentes en Maldonado.
La celda experimental PBR-3-B, que corresponde a la
muestra con benceno que es un hidrocarburo
aromtico, presenta un valor elevado de ln Ufc, lo que
sugiere una levada actividad del gnero Rhodococcus,
similar al observado en pruebas de laboratorio.
 RESULTADOS
Los valores de ln de las pruebas de campo
son aproximadamente 4,5 veces menores
que los obtenidos en condiciones de
laboratorio.
 Variacin de Ufc a 15 C, siembra
por diluciones vs directa
Comparativo 15 C, directa Vs CELDA Diluciones ln Directo ln
diluciones
1 3,39 4,44
7
2 3,05 5,73
6
3 3,43 4,53
5 4 2,33 3,37

4
5 2,81 4,02
ln Ufc

siembra directa
6 2,53 3,82
3 siembra dilusiones
TESTIGO 1,68 2,72
2

0
1 2 3 4 5 6 7
 Variacin Ufc a 4c, siembras
directas Vs diluciones

VARIACIN COMPARATIVA DE UFC, A 4C CON DILUCIN VS CELDA Ln Diluciones Ln Directo

DIRECTO
3.50 1 1,83 2,14
3.00 2 2,41 3,26
3 3,23 1,81
2.50
4 1,09 2,43
2.00 Variacin con
ln Ufc

dilusiones 5 1,38 2,92

1.50 Variacin Ufc a
4C directo
6 1,47 2,99
1.00
7 1,55 1,91
0.50

0.00
1 2 3 4 5 6 7
 Comparativo ln Ufc 15C vs 4C,
siembra directa y por diluciones

Comparativo dilusin a 4 y a 15C Comparativo directo a 4 y a 15C

4.00 7

3.50 6

3.00
5
2.50
4
ln Ufc

ln Ufc
2.00 Dilusin a 4C Directo a 4C
Dilusin a 15C 3 Directo a 15C
1.50
2
1.00

0.50 1

0.00 0
1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7
 Resultados, siembras a 4C y a 15C ,
por siembras directas y por
diluciones

Las diluciones empleadas fueron de 10-1 y 10-2

En todas las celdas invariablemente las
siembras directas muestran un valor de ln Ufc
superior a las siembras por dilucin.
El valor de ln Ufc de las siembras a 15C, son
superiores a los valores de Ufc a 4C.
 Resultados, siembras a 4C y a 15C ,
por siembras directas y por diluciones

El valor promedio de ln Ufc de las siembras

por diluciones a 15C es 1,48 veces superior
al valor de ln Ufc de las siembras por
diluciones a 4C.
El valor promedio de ln Ufc de las siembras
directas 15C es 1,64 veces superior al valor
de ln Ufc de las siembras directas a 4C.
 Resultados, siembras a 4C y a 15C ,
por siembras directas y por
diluciones

Las siembras directas a 4C son superiores en

1,34 veces a las por dilucin.
Las siembras directas a 15C son superiores
en 1,48 veces a las por dilucin.
 CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos demuestran que las
variaciones en ln de Ufc de las pruebas de laboratorio
en Ecuador a 4C, tienden al incremento.
Los valores de ln de las pruebas de campo (Antrtida)
son aproximadamente 4,5 veces menores que los
obtenidos en condiciones de laboratorio.
Los valores de las variaciones de ln Ufc de las pruebas
de campo muestran que los factores ambientales son
decisivos y ejercen una influencia directa sobre este
parmetro. (Gualoto., 2013).
 CONCLUSIONES
Un incremento en la temperatura promedio
ambiental, como consecuencia del calentamiento
global, modificara sustancialmente ln de Ufc, por el
metabolismo acelerado de las escazas fuentes de
carbono en el entorno antrtico. As lo ratifican las
siembras a 15C, con valores de ln promedio de 4,09 y
de 2,75 para siembras directas y por diluciones.
El calentamiento global favorecer al incremento de
la tasa de biodegradacin de hidrocarburos y a la
activacin de los microorganismos autctonos.
 CONCLUSIONES
La temperatura es un factor determinante
para el incremento de ln Ufc.
La tasa de degradacin de hidrocarburos es
directamente proporcional a ln Ufc.
 RECOMENDACIONES
Ampliar el tiempo de control de ln Ufc en
condiciones de campo y verificar su relacin con
la constante de degradacin de los
hidrocarburos.
Modelar proceso de biorremediacin con
microorganismos antrticos a distintas
temperaturas, con adicin de fuentes de N, P y
K.
Medir la actividad microbiana a travs de la
cantidad de CO2 generado e inferir el aporte de
la degradacin microbiana al calentamiento
global.
 RECOMENDACIONES
Verificar si las colonias identificadas en los
trabajos de campo, corresponden a las
inoculadas, mediante tcnicas de Biologa
molecular por secuenciacin de genes 16S
rRNA.
Basados en estos resultados inferir la
existencia de especies indicadoras del
calentamiento global, en funcin de su
presencia, ausencia y el valor de lnUfc.
 BIBLIOGRAFA
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