Tema 10: Clonacin y

Dr. Antonio Barbadilla

secuenciacin del DNA
Clonacin y secuenciacin del DNA 1
 Objetivos tema 10:
Clonacin y secuenciacin del DNA

Debern quedar bien claros los siguientes puntos:

Cmo se manipula el DNA?

Las endonucleasas (enzimas) de restriccin
Clonacin del DNA: DNA forneo, vector de clonacin,
organismo husped, seleccin de vectores
Vectores eucariticos
Organismos transgnicos
Sondeo de una secuencia de DNA en un conjunto
Mapas de restriccin
Polimorfismos de longitud de fragmentos de restriccin
La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)
La secuenciacin del DNA
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Clonacin y secuenciacin del DNA 2

 Manipulacin del DNA

Estudio de una secuencia especfica de DNA que suele encontrarse

en un conjunto heterogneo de secuencias.

Aislamiento, amplificacin, secuenciacin y expresin de un

fragmento de DNA especfico
Esta tecnologa se denomina:
Tecnologa del DNA recombinante, clonacin gnica o
ingeniera gentica
Ningn campo de la biologa ha permanecido igual tras esta revolucin tecnolgica

Propiedad bsica del DNA que permite su manipulacin:

El acoplamiento de cadenas por complementariedad. La

extraordinaria especificidad del reconocimiento entre secuencias
de bases complementarias constituye un poderoso instrumento
para la identificacin, aislamiento, clonacin,... De fragmentos de
DNA complementarios a uno dado
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Clonacin y secuenciacin del DNA 3

 Herramienta bsica

Endonucleasas (enzimas) de restriccin -> Enzimas de bacterias

que reconocen secuencias de DNA especficas y lo cortan por el
esqueleto azcar-fosfato.

Tipo I y III: cortan el DNA en puntos distintos al de

reconocimiento (al azar)

Tipo II: cortan justo en los puntos que reconocen, que son
repeticiones invertidas o palndromes

5-GGATCC- 3

3-CCTAGG- 5

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Clonacin y secuenciacin del DNA 4

 Dos tipos de cortes:
EcoRI: E. Coli
BamHI: Bacillus amyloliquefaciens Corte plano:
extremos romos
Corte escalonado:
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extremos pegajosos o
cohesivos
Clonacin y secuenciacin del DNA 5
 Herramienta bsica

Las enzimas de restriccin tipo II:

Proporcionan una forma de cortar el DNA de cualquier origen en

secuencias especficas, produciendo por tanto una poblacin
heterognea de fragmentos de extremos idnticos
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 Clonacin del
DNA
DNA forneo (secuencia que
se desea clonar) Vector
hbrido
Vector de clonacin
(vehculo)

Organismo husped (E. Coli)

Seleccin de vectores

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C Vectores
l hbridos
o
(quimera)
n
a Fragmentos de
distintas
c procedencias que
i se unen in vitro
tras cortarse con
la misma enzima
n de restriccin.
d Ligasa sella zona
e hbrida

l Vectores de
clonacin
D Plsmido (1 sitio
N de corte) 2-15 kb
A Fago
(Lambda)
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Csmido
Clonacin y secuenciacin del DNA 8
C
Fago
l
o Vectores de
n clonacin
a
c Fago (2 sitios de
i corte) < 24 kb

n
d Cromosomas
e artificiales P1
l (derivados del
bacterifago P1,
D pueden aceptar
insertos de 80 y 100
N kb
A
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Clonacin y secuenciacin del DNA 9

C Vectores de clonacin
l Csmido: extremos cos + DNA plsmido (origen replicacin)
o + DNA forneo + cpisde. ~50 kb
n
BAC (cromosoma artificial bacteriano): derivado del plsmido
a F, insertos de 150-300 kb. Usados en la secuencia de genomas
c
i Csmido

n
d
e
l

D
N
A
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Clonacin y secuenciacin del DNA 10

C
l
o Husped: E. coli
n
a
Insercin del vector hbrido en el husped:
c
i
Plsmido: transformacin (solucin diluida

cloruro de calcio) y replicacin autnoma

n
d
e Fago (transduccin, insercin en DNA
l husped)

D Csmido (transduccin como fago y

N replicacin como plsmido)
A
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Clonacin y secuenciacin del DNA 11

C Seleccin de vectores hbridos
l
o Plsmido: resistencia a antibiticos
n
a
c
i

n
d
e
l

D
N
A Fago : Insercin en E. coli (slo se puede
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empaquetar el DNA de si contiene el
inserto forneo)
Clonacin y secuenciacin del DNA 12
C Obtencin de la secuencia que se
l clona
o Un gen
n Aislamiento a partir del mRNA (ya no tiene
a intrones): uso de la transcriptasa inversa que
c hace cDNA (por ejemplo, 1982 primera insulina
i humana recombinante en bacterias)

n Sntesis automatizada de DNA in vitro: a

d partir de la secuencia aminoacdica se puede
hacer DNA con la ayuda del cdigo (no regin
e
promotora ni controladora de la expresin)
l ~100bp

D Fragmentos del genoma por digestin con enzimas

N de restriccin (aleotoria o perdigonada, Shotgun)
A Se obtiene genoteca, juego completo
fragmentos clonados del genoma del organismo
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Vectores eucariticos
Permite obtener las mximas ventajas de genes eucariotas

Vectores de levaduras: cromosomas artificiales de

levaduras (YACs):
Plsmidos + Secuencia replicadora + centrmero de
levadura + (telmero levadura)
Puede incorporar ms de 500 kb de DNA

Resistencia a antibitico
(p.e., ampr) Origen de replicacin
del DNA de levadura
(ARS)

Origen de replicacin Regin centromrica

bacteriano (ori) (CEN)

Linealizacin (con
endonucleasas) y adicin
de extremos telomricos

Telmero
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ampr ori CEN ARS Telmero

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 Transfeccin:
Introduccin de DNA forneo en eucariotas
Organismo transgnico: un eucariota con DNA forneo

Mtodos transfeccin
Clulas eucariotas toman DNA forneo del ambiente con
fosfato clcico (poco eficiente)

Inyeccin en el oocito: DNA incorporado en el cromosoma

(ratones transgnicos 15% eficiencia)

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Clonacin y secuenciacin del DNA 15

Mtodos transfeccin
Retrovirus: parte de su genoma se reemplaza con DNA
forneo (ejemplo: leucocitos humanos carecen enzima
adenosina desaminasa (ADA) se repararon por infeccin
viral)

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Clonacin y secuenciacin del DNA 16

Mtodos transfeccin

Electroporacin: se usa corriente elctrica para

introducir DNA

Liposomas: DNA se encapsula en liposomas (vesculas de

membrana artificial)

Biolstica (mitocondrias y cloroplastos): disparo de

proyectiles de tungsteno recubiertos por DNA

Plsmidos (Ti de Agrobacterium tumefaciens en plantas) y

elementos mviles (Elemento P en Drosophila)

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Clonacin y secuenciacin del DNA 17

 Sondeo de una secuencia de DNA en un conjunto
heterogneos de fragmentos

Poblacin de fragmentos

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Clonacin y secuenciacin del DNA 18

 Separacin fragmentos

Reptacin
de los
fragmentos
a travs del
gel de
agarosa

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 DNA teido
con bromuro
de etidio
emite
fluorescencia
con luz UV

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Clonacin y secuenciacin del DNA 20

 Sondeo de una secuencia de DNA en un conjunto
heterogneos de fragmentos
Se precisa de una sonda marcada (radioactividad, colorantes
fluorescentes,...), cDNA suele usarse como sonda

Transferencia en Southern (Southern blotting)

Transferencia Northern (Northern blotting): se hibrida con
RNA

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Clonacin y secuenciacin del DNA 21

 Transferencia en
Southern
(esquema resumen)

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Clonacin y secuenciacin del DNA 22

 Mapas de restriccin
mediante
enzimas de restriccin

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Clonacin y secuenciacin del DNA 23

Polimorfismos de longitud de fragmentos de restriccin
(RFLP)

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Clonacin y secuenciacin del DNA 24

 La reaccin
en cadena
de la
polimerasa
(PCR)

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Clonacin y secuenciacin del DNA 25

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Clonacin y secuenciacin del DNA 26

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Clonacin y secuenciacin del DNA 27

 Usos de la PCR
Secuenciacin
arqueologa,
DNA fsil (evolucin,
historia) DNA
traza
Fsiles
Mamut lanudo (40000
aos)
Abraham Lincoln
(sndrome de Marfan,
afecta tejido
conectivo, fribrilina)
Hombre Neandertal -
> Hablaba como
nosotros? Color
cabello?
Huellas dactilares del DNA
(DNA forense)
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Clonacin y secuenciacin del DNA 28

 Secuenciacin de DNA
La secuencia nucleotdica exacta de un fragmento de DNA
permite un conocimiento ms completo de la estructura y
funcin de un gen.

La base molecular de mutaciones especficas

en un gen pueden investigarse
Las secuencias del DNA han revelado regiones
reguladoras comunes a todos los genes
La comparacin de secuencias de diferentes
especies provee estimas de las tasas de
evolucin molecular
Secuenciacin de genomas: estructura del
genoma Disoxi

Mtodos:
Secuenciacin manual (inicial)
Qumico (Maxam y Gilbert 1977)
Didesoxi (Sanger 1977)
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Secuenciacin automatizada (1986,)

Clonacin y secuenciacin del DNA Didesoxi29
 Secuenciacin del DNA

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Clonacin y secuenciacin del DNA 30

 Secuenciacin automatizada del DNA

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Clonacin y secuenciacin del DNA 33

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Clonacin y secuenciacin del DNA 34

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Clonacin y secuenciacin del DNA 35

 Animaciones de tcnicas de la gentica
http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/animations.html

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Clonacin y secuenciacin del DNA 36