CURSO DE PRIMAVERA

PATOLOGA MOLECULAR DEL CNCER

Conceptos bsicos sobre ADN y ARN

Tcnicas de amplificacin (PCR y variantes)
Aplicaciones principales

Dr. Juan C. Cigudosa

Madrid
29 y 30 de mayo, 2014
SEAP- IAP
 Material hereditario: ADN

Nuestra informacin gentica est codificada en una

macromolcula: el ADN (cido dexoxirribonuclico).

El ADN con protenas forma los cromosomas. El material

bsico de los cromosomas es la cromatina.

46 cromosomas que se agrupan en parejas de

cromosomas homlogos (uno heredado del padre y
el otro de la madre)
2 metros de ADN en un ncleo de 0,005 mm dimetro

Nucleosoma: 8 Histonas+147 pb

Cromatina=(ADN+proteinas)
 El ADN como material gentico

Caractersticas del material gentico

Capacidad de almacenamiento
de la informacin

Capacidad de replicacin

Capacidad de expresin de la
informacin

Capacidad de variacin por

mutacin
 El ADN como material gentico

Caractersticas del material gentico

Capacidad de almacenamiento
de la informacin

Capacidad de replicacin

Capacidad de expresin de la
informacin

Capacidad de variacin por

mutacin
 ADN
1. Acido Desoxiribonucleico:
informacin gentica.
2. Polmero formado por
subunidades: nucletidos.

3. Nucletido est constitudo:

azcar
pentosa(desoxiribosa)+base
nitrogenada (A,T,C,G)+
grupo fosfato.
4. T y C pirimidinas; A y G
purinas.
5. T es complementaria a A
C es complementaria a G
6. Estructura de doble hebra
 Qu es una secuencia de ADN?
ADN: 4 caracteres
A (adenina), C (citosina), G (guanina), T (timina).

Las molculas de ADN estn compuestas por una secuencia de

millones de estos caracteres, de la misma manera que si
tuviramos un collar en los cuales cada perla es de un color de
cuatro posibles.

El orden de las bases en la secuencia es la manera de almacenar

la informacin: el ADN es la memoria qumica de los organismos
vivos.

La lectura de esta secuencia de bases es lo que denominamos

secuenciacin.
 GENOMA/GEN

GENOMA: todo el ADN contenido en el ncleo (no olvidar

que hay ADN en mitocondrias).

La unidad de informacin en el ADN es el GEN (formado por

nucletidos) que es una secuencia de ADN que contiene la
informacin para la produccin de protenas, as como las
instrucciones regulatorias para determinar cundo y en qu
cantidad se producirn esas protenas.
20000 genes aproximadamente
20-30 kb tamao medio de un gen (n exones muy variable
(media de 7-8)
 Estructura de un GEN

Regin codificante Regin no codificante

EXOMA
 El ADN como material gentico

Caractersticas del material gentico

Capacidad de almacenamiento
de la informacin

Capacidad de replicacin

Capacidad de expresin de la
informacin

Capacidad de variacin por

mutacin
 Replicacin del ADN
DEFINICION: una molcula original de ADN de doble cadena es convertida en
dos molculas hijas de ADN idnticas.
 El ADN como material gentico

Caractersticas del material gentico

Capacidad de almacenamiento
de la informacin

Capacidad de replicacin

Capacidad de expresin de la
informacin

Capacidad de variacin por

mutacin
 DOGMA DE LA BIOLOGA MOLECULAR

Complementariedad de bases nitrogenadas

 ARN
1. Acido Ribonucleico.
2. Polmero formado por
subunidades: nucletidos.

3. Nucletido est constitudo:

azcar (ribosa)+base
nitrogenada (A,U,C,G)+
grupo fosfato.
4. U y C pirimidinas; A y G
purinas.
5. U es complementaria a A
C es complementaria a G
6. Estructura monocatenaria

Severo Ochoa gan el Premio Nobel de Medicina en 1959 tras descubrir cmo se
sintetizaba el ARN
CODIGO GENTICO

43 = 64
codones

20 Aa

1e A
r
SIEMPRE
a
ATG/ Met

Codones
STOP
TAA/TAG/
TGA
Splicing alternativo
Modificaciones post-traduccionales
Los GENES se anotan en mayscula y cursiva
P53, BCR-ABL, EGFR, etc

Las PROTEINAS se anotan en minscula

p53, Bcr-Abl, Egfr, etc
 El ADN como material gentico

Caractersticas del material gentico

Capacidad de almacenamiento
de la informacin

Capacidad de replicacin

Capacidad de expresin de la
informacin

Capacidad de variacin por

mutacin
 El ADN como material gentico
El material gentico debe ser capaz de proporcionar una
fuente de variabilidad a travs del proceso de
mutacin.
Mutacin: cambio que afecta
a la composicin del ADN que
tendr su reflejo final en la
protena resultante.
Mutacin lnea germinal: afecta a los gametos, pasar
a la descendencia.

Mutacin somtica: Alteracin o cambio en la

informacin gentica (ADN) que ocurre despus de la
concepcin.
Este cambio podr ser beneficioso, neutral o perjudicial.
 Tipos de mutaciones

Mutaciones indel: Cambio de la secuencia de codones que debe ser leda durante
la traduccin, resultando en una protena completamente diferente, que no suele
ser funcional.
Tipos de mutaciones
 Tipos de mutaciones

Mutaciones no sinnimas: sustituciones nucleotdicas que cambian un

aminocido por otro (MISSENSE).
Mutacin sinnima: mutacin que altera la base situada en la tercera
posicin del codn pero no causa sustitucin aminoacdica (SILENT)
Mutacin sin sentido: mutacin por la cual un codn que especifica un
aminocido es cambiado a un codn de terminacin, dando lugar a una protena
truncada (NONSENSE).
 Polimorfismos
Definicin: variacin en la secuencia de un lugar determinado del
DNA entre los individuos de una poblacin. Debe aparecer por lo
menos en el 1% de la poblacin.

La mayor contribucin a la variacin gentica son los SNP (85%)

Cada 1000 b un SNP
 SNPs

Alrededor de 8 millones de SNPs en todo el genoma.

Algunos pueden producir cambios en protena:
- susceptibilidad a padecer enfermedades
- resistencia a tratamientos especfico
PREPARACION DE MUESTRAS,
EXTRACCION ACIDOS
NUCLEICOS Y CONSERVACION
DE MUESTRAS
 Muestras Biolgicas
1.- Tejido
Biopsa en fresco
- Biopsia enparafina

2.- Fluidos:
Heparina
- Mdula sea
- Sangre Perifrica
EDTA
- Saliva
- Lquido Cefalorraqudeo
- Lquido Pleural
- Lquido Pericrdico
Citrato
- Lquido Asctico
Sdico
- Lquido Sinovial
 Muestras Biolgicas

1) Citogentica
Convencional 3 ml de MO/SP
CARIOTIPO HEPARINA
2) Citogentica
Molecular FISH Corte OCT o
Parafina
3) BIOLOGIA
MOLECULAR Mnimo
EDTA
5 ml MO/SP Para
RQ-PCRm, 10 ml
de SP
OBTENCIN DE CIDOS
NUCLEICOS
 METODOS DE EXTRACCION DE ARN

1) Extraccin con Tiocianato de Guanidinio-Fenol-Cloroformo

2) Trizol: reactivo comercial
3) Columnas de silicagel (Rneasy Mini Kit-Qiagen)
4) Purificacin por afinidad con Oligo-dT (para mRNA)

Mtodos Extraccin de ADN

1) Extraccin con Fenol-Cloroformo-Isoamlico

2) Columnas de silicagel (DNAmp Mini Kit- Qiagen)

Mtodos automatizados
AC. [AC. NUCLEICO] PUREZA(Valor
NUCLEICO (g/l) ptimo)

ADN A260 x 50 x dilucin A260/A280 (1,80)

ARN A260 x 40 x dilucin A260/A280 (2,00)

 Extraccin ADN, ARN y protena

LISAR Y
HOMOGENEIZAR

LAVAR
PRECIPITAR

ELUIR

LAVAR
PRECIPITAR

DISOLVER ELUIR
CURSO DE PRIMAVERA
PATOLOGA MOLECULAR DEL CNCER

Conceptos bsicos sobre ADN y ARN

Tcnicas de amplificacin (PCR y variantes)
Aplicaciones principales

Dr. Juan C. Cigudosa

Madrid
29 y 30 de mayo, 2014
SEAP- IAP
 Tipos de PCR

PCR Sencilla: RFLP

PCR Anidada (Nested): Amplificacin de una secuencia dentro de
otra previamente amplificada
RT-PCR
PCR Mltiple: Varios targets diferentes en forma simultnea
Real Time PCR (RQ-PCR): PCR Cuantitativa
PCR MSP: metilacin
PCR Digital (2011)
Variantes de PCR: secuenciacin y pirosecuenciacin
 Tipos de PCR: PCR sencilla
Primers externos para amplificacin de una secuencia

Fragmento de amplificacin
 Tipos de PCR: PCR anidada
Dos rondas de amplificacin con diferentes pares de primers

Reaccin 1
Primers externos
para amplificacin
de una secuencia
extensa

Reaccin 2
Primers internos
para amplificacin
de una regin SEGUNDA PCR

especifica

Aumentar ESPECIFICIDAD

Aumentar SENSIBILIDAD (10-6)

 Tipos de PCR: RT-PCR
Deteccin de la expresin de un gen por presencia de mRNA

mRNA

Enzima mRNAcDNA : Retro-transcriptasa

cDNA

PCR Enzima Taq polimerasa

 Tipos de PCR: PCR Mltiple
Reacciones que consiguen amplificar simultneamente y en
un nico tubo diferentes secuencias diana.

Aplicacin.
1)Multiplex-PCR control calidad de una muestra:
amplificacin de 4 genes constitutivos distintos.
2) Multiplex-PCR LAL-B infantil: amplificacin de una
de las 4 posibles translocaciones que estudiamos.
3)ARMS-PCR: Amplificacin por PCR de Alelos
Especficos.
 Tipos de PCR: PCR Mltiple

Amplificacin 4 genes simultneamente

BCR (377 pb)

2MG (287 pb)

ABL (193 pb)

PBGD (128 pb)
 Tipos de PCR: PCR Mltiple

Amplificacin 4 translocaciones simultneamente LAL-B infantil

t(4;11) MLL-AF4
t(1;19) E2A-PBX1
t(12;21) TEL-AML1
Controles Positivos t(9;22) BCR-ABL

ADNc individuo con la

t(9;22) e1a2

POSITIVO
Tipos de PCR: Real Time PCR (RQ-PCR): PCR Cuantitativa

-CUANTIFICACIN de la expresin de genes o

reordenamientos.
- Ms rpida y menos laboriosa.
 Tipos de PCR: RQ-PCR
Medida de seal de fluorescencia en la fase exponencial del
proceso de PCR a tiempo real
Fundamento
1.Deteccin y cuantificacin de la seal, emitida por un
reporter fluorescente, que aumenta en proporcin directa a la
cantidad de producto de PCR
2.Termociclador con sistema de deteccin capaz de c uantificar
la seal emitida por el reporter
 Tipos de PCR: RQ-PCR

CUANTIFICACION RELATIVA

Expresin de un gen en una muestra problema

en relacin a la expresin de dicho gen en controles
normales.

CUANTIFICACION ABSOLUTA

Deteccin del N Copias exacto de un gen o

de un gen de fusin mediante la comparacin con
estndares de concentracin conocida.
 Tipos de PCR: RQ-PCR

Qumica de la Reaccin.
Bufer, MgCl2, dNTPs, Taq-Polimerasa (enzima), cebadores o
primers, reactivo fluorescente, agua ultrapura, molde
ADN.

Ciclos Trmicos.
Desnaturalizacin: Separacin de las cadenas de ADN
molde y activacin de la Taq-Polimerasa (95 C).
Hibridacin y Extensin: Reconocimiento de los primers
con su secuencia complementaria y actividad de la Taq-
Polimerasa (60C).
 Tipos de PCR: RQ-PCR

Qumica de la Reaccin.
Bufer, MgCl2, dNTPs, Taq-Polimerasa (enzima), cebadores o
primers, reactivo fluorescente, agua ultrapura, molde ADN.

Ciclos Trmicos.
Desnaturalizacin: Separacin de las cadenas de ADN
molde y activacin de la Taq-Polimerasa (95 C).
Hibridacin y Extensin: Reconocimiento de los primers
con su secuencia complementariay actividad de la Taq-
Polimerasa (60C).
 Tipos de PCR: RQ-PCR
Fundamento
QUIMICO
Ag. Intercalantes (SYBR Green)

REACTIVOS Sondas de Hidrlisis

FLUORESCENTES (TaqMan)

Sondas de Hibridacin

Sondas de Horquilla (Molecular Beacons)

 Tipos de PCR: RQ-PCR
Fundamento
QUIMICO
SYBR Green
Fase annealing Fase extensin (I)

Fase extensin (II) Fin del ciclo de PCR

 Tipos de PCR: RQ-PCR
Fundamento
QUIMICO
SYBR Green
Ventajas
- simple y econmico
- fcil de usar
- sensible (10-6)
- verstil (no se necesitan sondas especficas)
Desventajas
- sobrestimacin de la cantidad de molde por la unin del SYBR
Green a dmeros de primer y a otros productos inespecficos
- necesario hacer una curva de melting
 Tipos de PCR: RQ-PCR
Fundamento
QUIMICO
Sondas de Hidrlisis (Sondas TaqMan)
Fase annealing Fase extensin (I)

Fase extensin (II) Fin del ciclo de PCR

 Tipos de PCR: RQ-PCR

Sondas de Hidrlisis (Sondas TaqMan)

Ventajas
-especificidad
-libreras de cebadores y sondas en las casas
comerciales
Desventaja
- diseo de cebadores y sonda para genes que
no se han estudiado (Primer Express)
 Tipos de PCR: RQ-PCR

Qumica de la Reacci n.
Bufer, MgCl2, dNTPs, Taq-Polimeras a (enzima), cebadores o
primers, reactivo fluorescente, agua ultrapura, molde ADN.

Ciclos Trmicos.
Desnaturalizacin: Separacin de las cadenas de ADN
molde y activacin de la Taq-Polimerasa (95 C).
Hibridacin y Extensin: Reconocimiento de los primers
con su secuencia complementaria y actividad de la Taq-
Polimerasa (60C).
Tipos de PCR: RQ-PCR
FUNDAMENTO TERMICO RQ-PCR
 Tipos de PCR: RQ-PCR

Producto de amplificacin

Fase de plateau o saturacin

Fase exponencial

Ciclo umbral (CT)

Ruido de fondo

CT (ciclo umbral):ciclo en el que la intensidad de emisin del fluorocromo

aumenta significativamente con respecto al ruido de fondo
 Tipos de PCR: RQ-PCR
INTERPRETACION RESULTADOS RQ-PCR (I)
PRESENCIA (N COPIAS)/AUSENCIA

CT muestra

Log dilucin
 Tipos de PCR: RQ-PCR

-Amplificacin robusta y fiable

-Alta especificidad y sensibilidad
-Alta precisin y exactitud
-Cuantifica producto de PCR en cada ciclo
-Capacidad de realizar mayor nmero de reacciones al da
-No requiere anlisis posterior a la PCR (electroforesis)
-Mayor control de contaminacin
-Amplio rango de aplicacin: reordenamientos IgH o TCR
fusin de genes a nivel DNA
fusin de genes a nivel cDNA
genotipado

expresin gnica
 Tipos de PCR: PCR Digital (ddPCR)

1 2 3

X target
copies

Hacer gotas PCR gotas Leer gotas Cuantificacin

PCR Real-time PCR Droplet Digital PCR
Cualitativa Cuantificacin relativa Cuantificacin absoluta

Droplet Digital PCR (ddPCR) 3

Generacin
 Tipos de PCR: PCR Digital (ddPCR)
Ventajas
Aumento de seal / ruido. DNA de alto nmero de copias y background
se diluyen, enriqueciendo los DNA escasos y permite un 10 % de
precisin
Eliminacin de los sesgos de la PCR. Las tasas de error se reducen
mediante la eliminacin de la dependencia de amplificacin de la
eficiencia, permitiendo deteccin de pequeas diferencias (1,2 X)
Simplificacin de la cuantificacin. Con ddPCR no necesitamos
estndares para la cuantificacin absoluta relativa.
Reduccin del coste del reactivo. reaccin son picolitros-nanolitros en
volumen, reduciendo muestra reactivo y entrada

Desventajas
Precio de la plataforma

SENSIBILIDAD 10-7
 Secuenciacin (PCR modificada)

Qu es la secuenciacin?

Metodologa

Terminadores/Sanger

Pirosecuenciacin

Nueva generacin de secuenciadores

Anlisis de secuencias

Ejemplos de secuenciacin
Sanger F et al. J Mol Biol. 1975 (3):441448
Maxam AM, Gilbert W. Proc Natl Acad Sci U S A. 1977 ;74(2):560-4

M Ronaghi et al. Analytical Biochemistry. 1996;242:84-85

Shenduret et al. Nat Biotecnology. 2008: 26

 Secuenciacin (PCR modificada)

1) Reaccin de Secuenciacin: Mtodo de Sanger

(marcaje fluorescente de las molculas de ADN
amplificadas por PCR)
2) Separacin de molculas marcadas:
- electroforesis en gel de acrilamida
desnaturalizante
- electroforesis capilar
 Secuenciacin (PCR modificada)

La fluorescencia emitida por cada fragmento de ADN,

corresponde a la emisin de fluorescencia del nucletido
incorporado en 3
 Secuenciacin (PCR modificada)

1) Reaccin de Secuen ciacin: Mtodo de Sa nger

(marcaje fluorescen te de las molculas de ADN
amplificadas por PCR)
2) Separacin de molculas marcadas:
-electroforesis en gel de acrilamida
desnaturalizante
- electroforesis capilar
 Secuenciacin (PCR modificada)

Cada uno de los carriles corresponde con una muestra, y cada una
de las bandas de colores con una de las bases del ADN . El
ordenador identifica color con base y dibuja un cromatograma con
los picos de colores y su correspondiente base.
 Secuenciacin (PCR modificada)
Mtodo enzimtico/Teminadores/Sanger

Purificacin de los productos de secuenciacin

Secuencia correcta

CROMATOGRAMA

Terminadores
 Secuenciacin (PCR modificada)
Mtodo enzimtico/Teminadores/Sanger

Revisin visual de los electroferogramas.

Longitud de secuencia adecuada
Valores de calidad mnimos

Uso de programas informticos para el anlisis.

Comparar secuencias en ambas direcciones.
Comparar las muestras con una secuencia de
referencia (sin mutaciones)
 Secuenciacin (PCR modificada)

Tipos de discrepancias con la secuencia de referencia:

1.Polimorfismos
- Mutaciones Puntuales
- Deleciones
- Inserciones
- Translocaciones
- Inversiones
2. Artefactos de la secuenciacin
 Secuenciacin (PCR modificada)
Mtodo enzimtico/Teminadores/Sanger

Ventajas Desventajas

Experiencia Baja capacidad

Gold estndar Sensibilidad baja

nico Mtodo?? No es cuantitativo

Coste por base
Secuenciacin Masiva (PCR modificada)
 Tipos de PCR: RT-PCR

oligo(dT)n Primer (n = 10 20)

mRNA poly(A) tail

TTTTTTTTTTTTTTT
cDNA

Random Primer p(dN)x (x = 6 -9)

mRNA poly(A) tail

cDNA
NNNNNN
NNNNNN NNNNNN

Gene-specific Primer
Unin especfica a la secuencia homloga
for 1-step RT-PCR
 Tipos de PCR: PCR Mltiple
ARMS-PCR (Amplificacin por PCR de Alelos Especficos)

C1 C3
G
1849G>T
T

C4 C2
Control 463 pb
Mutante 279 pb
Normal 229 pb

C3+C2: Amplificacin del alelo normal

C1+C4: Amplificacin del alelo mutado
C1+C2: Amplificacin Control Interno
 Tipos de PCR: PCR Mltiple
C1
G
1849G>T
T
JAK2 Mutacin V617F
C4 C2
ADN de pacientes con la
Control 463 pb
Mutante 279 pb
mutacin
Normal 229 pb

Control Interno
Alelo Mutado
Alelo Normal

ADN pacientes sin la

mutacin

Mutacin en homocigosis o heterocigosis: no se conoce la implicacin clnica

Tipos de PCR: PCR MSP