ENZIMOLOGIA

algunas ideas sueltas

qu es una enzima?
Ejemplos de actividad enzimatica
Dibuje enzima sustrato vs receptor ligando
Qu entiende por catalisis?
 Condiciones fundamentales para la vida

Los organismos deben ser capaces de

autorreplicarse

Deben ser capaces de catalizar reacciones

selectivamente y eficientemente
 La oxidacin de la sucrosa podra no ocurrir en
Una escala de tiempo que sustente la vida.

energa CO2 + H2O

azcar metablica (oxgeno)

Reaccin exergnica libera ENERGIA

Reaccin CATALIZADA por enzimas
 Enzimas
La mayora son protenas altamente especializadas

Tienen un enorme poder cataltico, mucho mas grande que la catlisis

inorgnica o sinttica

Poseen un alto grado de especificidad por su sustrato

Aceleran tremendamente las reacciones qumicas

Funcionan en ambientes acuosos bajo suaves condiciones de

temperatura y pH.
 S. Altman y T. Cech (1981) se descubri que determinados tipos de RNA pueden catalizar su propia sntesis,
hecho este que oblig a revisar algunas de las ideas preexistentes acerca de la naturaleza de los
biocatalizadores.

J.B.S. Haldane (1930-1936) expuso la idea de que los enzimas establecen 3 interacciones dbiles con el sustrato para
distorsionarlo y catalizar as su transformacin; esta idea result capital para el moderno conocimiento de la accin
enzimtica

J.B. Sumner (1926) aisl un enzima, la ureasa, en forma cristalina pura y demostr
que los cristales estaban formados por protenas.

E. Bchner (1897) consigui extraer de las clulas de la levadura las enzimas que catalizan la fermentacin alcohlica,
demostrando que stas pueden actuar independientemente de la estructura celular.
Este hecho permiti estudiar "in vitro" la actividad y propiedades de los enzimas, aislarlos en estado puro y analizar su
composicin.

Louis Pasteur (1860) propuso que la fermentacin del azcar para transformarse en alcohol era inducida por
ciertos catalizadores biolgicos, razn por la cual los enzimas fueron llamados inicialmente "fermentos".

Pasteur supuso que dichos catalizadores se hallaban unidos de modo indisoluble a la estructura de las
clulas de la levadura por lo que no podan actuar fuera de estas
Enzima: Protena dotada de actividad cataltica

- Enzimas proteolticas
- Desnaturalizacin de enzimas
- Purificacin de enzimas
- Sntesis completa de una enzima

A pesar de la existencia de las Ribozimas, se acepta que las

Enzimas son de carcter proteico.

Peso Molecular: 12,000 hasta mas de 1 milln

Estructura de una enzima

Enzymes are proteins

They have a globular shape
A complex 3-D structure

Human pancreatic amylase

Cofactor: componente qumico necesario para la actividad enzimtica
 Cofactores

Los cofactors que se unen

estrechamente son llamados
grupos prostticos.

Los cofactors que estn unidos y

se liberan facilmente son
llamados Coenzimas

Muchas vitaminas son Coenzimas

Nitrogenase enzyme with Fe, Mo and ADP cofactors

Jmol from a RCSB PDB file 2007 Steve Cook
H.SCHINDELIN, C.KISKER, J.L.SCHLESSMAN, J.B.HOWARD, D.C.REES
STRUCTURE OF ADP X ALF4(-)-STABILIZED NITROGENASE COMPLEX AND ITS

IMPLICATIONS FOR SIGNAL TRANSDUCTION; NATURE 387:370 (1997)

Coenzima: complejo orgnico o metalorgnico con
accin transiente y especfica
The active site

One part of an enzyme, the active

site, is particularly important
The shape and the chemical
environment inside the active site
permits a chemical reaction to
proceed more easily
The substrate
The substrate of an enzyme are the
reactants that are activated by the
enzyme
Enzymes are specific to their
substrates
The specificity is determined by the
active site
 Sitio activo

cavidad existente en la enzima formada por una serie aminocidos.

los aminocidos que forman parte del sitio activo no se encuentran
contiguos en la cadena polipeptdica, sino ocupando posiciones a
veces muy alejadas en la misma.
El hecho de que estos aminocidos coincidan prximos entre s sobre
el sitio activo no es ms que una consecuencia del plegamiento
caracterstico de la cadena polipeptdica; es decir, de la conformacin
tridimensional nativa de la protena enzimtica.
 Sitio activo conformado por diferentes aa

Aminocidos catalticos: uno o ms aminocidos cuyas cadenas

laterales (R) desarrollan la funcin cataltica. Constituyen el verdadero
centro cataltico del enzima.
Aminocidos de unin: serie de aminocidos cuyas cadenas laterales
R poseen grupos funcionales que pueden establecer interacciones
dbiles (puentes de hidrgeno, interacciones inicas, etc.) con grupos
funcionales complementarios de la molcula de sustrato. Su funcin
consiste en fijar la molcula de sustrato al sitio activo en la posicin
adecuada para que los aminocidos catalticos puedan actuar
Las enzimas cumplen su papel cataltico gracias a:

- Fijacin estereoqumicamente complementaria

del substrato

- Transformacin cataltica del mismo

En ambas funciones participan:

- Cadenas laterales de los aminocidos

- Grupos o molculas no proteicas:
- Grupos prostticos
- Iones metlicos
- Cofactores
Substrato: molcula(s) sobre la(s) que acta la enzima

Actividad enzimtica: velocidad a la que cursa la reaccin

enzimtica

Velocidad: variacin de la concentracin en la unidad de tiempo

Unidades:
katal: moles.s-1
U.I.: mmoles.min-1 (a 25C)

La velocidad es directamente proporcional de la concentracin

de enzima; por tanto, la velocidad es una medida de la concen-
tracin de enzima en una preparacin.
Activador: Agente que aumenta la actividad enzimtica

Inhibidor: Agente que disminuye la actividad enzimtica

Inhibidor reversible: establece un equilibrio con la enzima:

E+I EI

Inhibidor irreversible: modifica qumicamente a la enzima:

E+I E
Cofactor (Coenzima):

tomo, ion o molcula que participa en el proceso

cataltico sin ser enzima ni substrato.

Los cofactores participan de dos maneras distintas:

1. A travs de una fijacin muy fuerte a la protena y salen

sin ser modificados del ciclo cataltico

2. Como un segundo substrato; salen modificados del ciclo

cataltico y por lo general requieren otra enzima para volver
al estado original.
Aminocido
LAO Cetocido
R CH COO- + O2 + H2O R CO COO- + H2O2 + NH4+
NH3+
LAO: L-aminocido oxidasa: es una flavoprotena

Las flavoprotenas tienen un grupo prosttico flavnico,

que interviene en el proceso cataltico sin salir modificado
del mismo

O
H3C N
NH

H3C NH N O
 Piruvato L-Lactato

COO- COO-
LDH
C O HO C H
CH3 CH3
NADH + H+ NAD+

LDH: Lactato deshidrogenasa

Utiliza como cofactor NADH, el cual sale de la reaccin

oxidado a NAD+. La regeneracin a NADH requerira otra
enzima.
 Isoenzimas: formas moleculares distintas de una enzima dentro
del mismo organismo

Hexokinasa: Presenta, al menos, cuatro formas distintas

- Heptica
- Cerebral
- Muscular
- Eritrocitaria

Las isoenzimas representan formas que tienen que ver con

la diferenciacin celular, presentando distintas caractersticas
funcionales.
Unidad de enzima
cantidad de enzima capaz de catalizar la transformacin de una determinada
cantidad de sustrato en cierta unidad de tiempo.
Internacionalmente, se acepta:
cantidad de enzima que cataliza la transformacin de
1 mol de sustrato en 1 minuto a 25C

se debe precisar siempre las condiciones experimentales empleadas,

temperatura, pH, concentracin de sustrato, coenzima, activadores, etc.
 Especificidad propiedad de actuar solo sobre un determinado sustrato

Grasa

Enzima Enzima

La Amilasa Salival En cambio,

hidroliza el almidn pero es

incapaz de convertir la
H de C ambos compuestos
orgnicos son hidrolizados
maltosa en dos glucosas por un cido diluido caliente
Extraccin y Purificacin de Enzimas
Extraccin: homogeneizacin del tejido: ruptura de membrana

Homogeneizador Homogeneizador
Potter-Elvehjem de rotor y estator
Extraccin: homogeneizacin del tejido: consideraciones

Buffer o solucin amortiguadora

Butanol, para enzimas mitocondriales
Detergentes, como sales biliares
Baja temperatura
Trabajo rpido
Figure 4.1Differential Centrifugation
Cells are disrupted in a homogenizer and the
resulting mixture, called the homogenate, is
centrifuged in a step-by-step fashion of
increasing centrifugal force. The denser
material will form a pellet at lower centrifugal
force than will the less-dense material. The
isolated fractions can be used for further
purification. [Photographs courtesy of S.
Fleischer and B. Fleischer.]
 Purificacin de enzimas

Las protenas pueden ser purificadas de acuerdo a su

solubilidad, tamao, carga y unin por afinidad especfica
Generalmente, la mezcla de protena est sujeta a una serie de
purificaciones, cada una de ellas basada en diferentes
propiedades para lograr obtener la enzima pura.
En cada etapa de purificacin, la preparacin es ensayada y se
determina la concentracin de protenas totales.
Se requiren cantidades importantes, del orden de miligramos
para dilucidar la estructura tridimensional y el mecanismo de
accin de la enzima.
Purificacin de enzimas: precipitacin por sales

La solubilidad de una protena depende de la fuerza inica

del medio. Normalmente se utiliza sulfato de Sodio o Sulfato
de Amonio.
 Purificacin de enzimas: dilisis

Proteins can be separated from small molecules

by dialysis through a semipermeable membrane, such as a
cellulose membrane with pores. Molecules having
dimensions significantly greater than the pore diameter are
retained inside the dialysis bag, whereas smaller molecules
and ions traverse the pores of such a membrane and emerge
in the dialysate outside the bag. This technique is useful for
removing a salt or other small molecule, but it will not
distinguish between proteins effectively

Protein molecules (red) are retained within the dialysis bag,

whereas small molecules (blue) diffuse into the surrounding
medium.
 Purificacin de enzimas: cromatografa por filtracin en gel
A mixture of proteins in a small volume is applied to a column
filled with porous beads. Because large proteins cannot enter the
internal volume of the beads, they emerge sooner than do small
ones.
More discriminating separations on the basis of size can be
achieved by the technique of gel-filtration chromatography.
The sample is applied to the top of a column consisting of porous
beads made of an insoluble but highly hydrated polymer such as
dextran or agarose (which are carbohydrates) or polyacrylamide.
Sephadex, Sepharose, and Bio-gel are commonly used
commercial preparations of these beads, which are typically 100
m (0.1 mm) in diameter. Small molecules can enter these beads,
but large ones cannot.
The result is that small molecules are distributed in the aqueous
solution both inside the beads and between them, whereas large
molecules are located only in the solution between the beads.
Large molecules flow more rapidly through this column and
emerge first because a smaller volume is accessible to them.
Molecules that are of a size to occasionally enter a bead will flow
from the column at an intermediate position, and small molecules
which take a longer, tortuous path, will exit last.
Figure. Proteins eluting later from a gel filtration column become diluted. The figure
shows an idealized chromatogram illustrating equimolar amounts of three proteins
eluting at different times from a gel exclusion matrix. Note that the later peaks are
broader and not as intense. Proteins eluting earlier show sharper peaks.
 Purificacin de enzimas: cromatografa intercambio inico

If a protein has a net positive charge at pH 7, it will usually bind to

a column of beads containing carboxylate groups, whereas a
negatively charged protein will not

A positively charged protein bound to such a column can then be

eluted (released) by increasing the concentration of sodium chloride
or another salt in the eluting buffer because sodium ions compete
with positively charged groups on the protein for binding to the
column.

Proteins that have a low density of net positive charge will tend to
emerge first, followed by those having a higher charge density.

Positively charged proteins (cationic proteins) can be separated on

negatively charged carboxymethyl-cellulose (CM-cellulose)
columns. Conversely, negatively charged proteins (anionic proteins)
This technique separates proteins can be separated by chromatography on positively charged
mainly according to their net charge. diethylaminoethyl-cellulose (DEAE-cellulose) columns.
Figure. Elution of protein from an anion exchange column.
Beads are shown in blue, protein in red; buffer ions are white
circles. The protein is passed over the column and binds. Then
an increasing salt gradient is passed over the column, displacing
the protein.
Figure. The charge of a protein determines the type of ion
exchange resin to be used.
 Criterios de pureza
Entre los criterios que permiten asegurar la pureza de una
enzima, se pueden citar:

Ausencia de otras actividades enzimticas medibles

La actividad especfica constante despus de varias
cristalizaciones
La especificidad inmunolgica
Cmo trabaja una enzima
 Catlisis

Ea

Ea

DG DG

Reaccin Reaccin
no catalizada catalizada
Velocidad de reaccin cataltica

Se ha podido comprobar que los aumentos de velocidad que

producen las enzimas son de entre 107 y 1014 veces la velocidad de la
reaccin no catalizada.
La actividad molecular (nmero de molculas de sustrato
transformadas por una sola molcula de enzima por minuto) de
distintos enzimas oscila entre unos pocos miles y varios millones de
molculas de sustrato por minuto.
cmo consiguen los enzimas aumentos tan espectaculares en la
velocidad de las reacciones qumicas que catalizan?
The Lock and Key Hypothesis

S
E
E
E

Enzyme- Enzyme may

substrate be used again
complex P

Reaction coordinate
2007 Paul Billiet ODWS
Cintica enzimtica