Cromatografa

Descubridor
El botnico ruso Mikhail
Tswett (Mikhail Semenovich
Tsvett, 1872-1919)
 Definicin
Cromatografa es un mtodo de
separacin en el que se aprovechan
las diferencias en el comportamiento
de particin entre una fase mvil y
una fase estacionaria para separa los
componentes de una mezcla.
 Cromatografa, definicin
(cont.)
Una columna u otro soporte mantienen a
la fase estacionaria y la fase mvil acarrea
a la muestra.
Los componentes de la muestra que
particionan fuertemente con la fase
estacionaria estarn ms tiempo dentro de
la columna.
 Si es en columna :

Conforme los componentes son

eluidos de la columna, pueden ser
cuantificados por un detector y
colectados para anlisis posterior
Mtodos cromatogrficos
De gases
En capa fina
En lquidos inmovilizados
De exclusin molecular
Intercambio inico
Hidroxiapatita
Hidrofbica
Afinidad
HPLC
Exclusin molecular
Fase estacionaria:
Dextrn con enlaces cruzados
Agarosa con enlaces cruzado
Poliacrilamida
Las molculas grandes fluyen ms
rpido que las pequeas.
 Desarrollo de una
cromatografa de exclusin
molecular

Determinacin del tamao de la

columna
Hidratacin y lavado de la resina
Empaque de la columna
Determinacin del volumen vaco
Corrimiento de la muestra
 Cromatograma de
exclusin molecular (EM)
Elusin de una columna de cromatografa de EM
Cromatografa de
exclusin
 Caractersticas de las
resinas de EM clsicas
Rango de
Nombre Cdigo Fraccionamiento Flujo mximo
(kDa) (cm/hr)

BioGel P-60 3-60 5

P-100 5-100 5
P-200 30-200 4
P-300 60-300 3
Sephadex G-50 2-30 5
G-100 4-150 5
G-150 5-300 3
G-200 5-600 2
Intercambio inico
 Intercambio inico
Las protenas difieren mucho en su afinidad
por materiales cargados positiva o
negativamente.
Los soportes pueden ser:
Dextrn con enlaces cruzados
Agarosa con enlaces cruzado
Poliacrilamida
Celulosa
Poliestireno
Slice
 Grupos
intercambiadores
Fosfato (P) PO3-
Carboximetilo (CM) CH2 COO-
CH2 CH3
+
Dietilaminoetil (DEAE) (CH2)2NH

Mono Q CH2 CH3

CH2 N+ (CH3)3
 Principios del
intercambio inico

La afinidad de una protena es proporcional

a la concentracin de sal requerida para
liberarla del material.
Una columna se carga (de protenas) con un
amortiguador de baja fuerza inica y la
elusin se inicia por incremento de la
concentracin del amortiguador de elusin.
 Desarrollo de una
cromatografa de
intercambio inico
Hidratacin y Lavado de la resina
Activacin (lavado con cido y base fuerte
diluidos, HCl 1M seguido de NaOH 1M y
finalmente con la sal que se usar ej. NaCl
1M y equilibrar con buffer sin sal)
Volumen de la columna y capacidad de
retencin de la resina.
 Diferentes sales tienen
diferentes fuerzas de elucin
cuando se usan en
cromatografa de intercambio
inico.
Intercambio del anin
citrato>sulfato>oxalato>I->NO3-
2 >CrO4->Br- > SCN- > Cl- > Formiato
Intercambio del catin
Ba2+ > Pb2+ > Sr2+ > Ca2+ > Ni2+ > Cd
> Cu > Co > Zn>Mg>Ti+> Ag >
Rb+>Cs+>K+>NH4+>Na+>H+>Li+
 Amortiguadores
Para intercambiadores aninicos
se deben usar amortiguadores
catinicos o zwitterionicos
No usar amortiguadores aninicos
pues se unen a la resina.
Usar detergentes catinicos o no
inicos.
 Cromatograma de
intercambio inico
b 53

500

NaCl mM
A 280 nm

0 30 60 90

Tiempo de retencin (min)

 Hidroxiapatita (HA)

Introducida por Tiselius et al. en

1956
Bernardi realiz un estudio
sistemtico (Meth. In Enzimol. Vol.
22 y 27)

TiseliusAetal.,(1956)Proteinchromatographyoncalciumphosphate
columns,ArchBiochemBiophys65,132155
 Frmula
Forma cristalizada de fosfato
de calcio

(Ca10(PO4)6(OH)2)

KawasakiTetal.,(1985)Hydroxyapatitehighperformanceliquidchromatography:
columnperformanceforproteins,EurJBiochem152,361371
 Unin selectiva de
protenas a la

hidroxiapatita
A, es una protena bsica.
B, es una protena
acdica
El tringulo indica
enlaces de coordinacin.
Los dobles parntesis
indican repulsin.
Las lneas punteadas
indican enlaces inicos.

Losgruposaminosonatradosporlossitiosfosfatopero
repelidosporlossitioscarboxilo.Estoesalcontrariopara
loscarboxilos.
 Adsorcin de grupos
amino
Se debe a interaccin
electrosttica no especfica entre
su cargas positivas y las cargas
generales negativas de la columna
de HA cuando la columna es
equilibrada con amortiguador de
fosfato.
 Incremento de la unin de
aminas por bloqueo de la
repulsin.
A, es una protena bsica.
B, es una protena
acdica
El tringulo indica
enlaces de coordinacin.
Los dobles parntesis
indican repulsin.
Las lneas punteadas
indican enlaces inicos.

Losgruposfosfatosensolucinpuedencubriracalciosque
repeleranalosgruposaminos.
 Disociacin selectiva de la
hidroxiapatita
A, es una protena
bsica.
B, es una protena
acdica
El tringulo indica
enlaces de
coordinacin. Notar
que estos no se
afectan.
 Efecto de la concentracin
de fosfato en la unin de
protenas
El perfil superior fue
cargado con fosfato 1
mM
El inferior, con
fosfato 50 mM.
La capacidad de
unin de las IgG se
mejor reduciendo la
competencia de
contaminantes.
 Barrido con dos
gradientes
El primer gradiente
va de 0 a 500 mM de
cloruro de sodio.
El segundo, de 0 a
500 mM de fosfato de
potasio.
El amortiguador base
es 0.5 M MES, 1mM
fosfato, pH 6.
La elusin de la IgG
se observa en gris
 Usos

Purificacin de:
Protenas
cidos nuclicos
Virus
 Bases de la
Tcnica

Su selectividad no depende de la
masa molecular, densidad de
carga o punto isoelctrico.
 Bases de la tcnica
La adsorcin y la elucin de las protenas no
son procesos en reversa de un solo efecto.
Los grupos amino y carboxilo actan de
manera diferente en la adsorcin de las
protenas a la HA.
La elucin de protenas cidas y bsicas por
diferentes sales tiene deferentes
mecanismos.
 Ventajas
HA tiene poco poder de adsorcin de
molculas de masa molecular baja
como nucletidos, sales y aminocidos.
Es relativamente incompresible.
Existen variantes cermicas ms
fciles de trabajar pues no se
compactan.
Cromatografa
hidrofbica
 Cromatografa
Hidrofbica
Los grupos adicionados al soporte son
el alcohol octlico, grupos
bencnicos u otros grupos
hidrfobos como hidrocarburos
(C4, C8 o C18).
Los centros hidrfobos de las protenas
son expuestos por exceso de salinidad
y son atrapados por la columna.
Cromatograma
hidrofbico
b 53

(NH4)2SO4 mM
500
280 nm

0
A

0 30 60 90

Tiempo de retencin (min)

 Series caotrpicas

Aniones
PO4>SO4>CH3COO>CL>Br>NO3>ClO4
>I>SCN
Cationes
NH4+>Rb+>K>Na+>Cs+>Li+>Mg>Ca2+>Ba2+
 Cromatografa de
Afinidad
Sistema muy poderoso de purificacin
Sistema restringido
Se basa en la interaccin especfica de
dos compuestos
Antgeno - Anticuerpo
Enzima - sustrato
Receptor - Ligando
 HPLC

Cromatografa lquida de
alta resolucin
High-performance liquid
chromatography
 Limitaciones de la
cromatografa a bajas
presiones
Imposibilidad fsica de
aumentar el flujo
Resinas compresibles
Corridas de muchas horas
Grandes volmenes
 Descubrimientos que
facilitaron la HPLC
Sntesis de resinas
incompresibles
Nuevas tcnicas en el empaque
de las columnas
Microparticulacin de las resinas
Adelantos en la tecnologa
espectrofotometrica
 Tipos de HPLC

De exclusin molecular
Intercambio inico
Hidrofbica
Afinidad
De fase reversa
 Instrumentacin
Sistema de bombeo
Resistente a qumicos
Poca variabilidad
Presiones de 30 as 400 atm
Flujo constante (libre de pulsos)
Buen mezclado de los solventes
Reproducibilidad en la formacin de los
gradientes
 Tipos de bombas
Jeringa
Pistn recproco
Diafragma
Presin constante
 Detectores
Detectores de UV-Visible que
pueda leer 2 o ms longitudes
de onda al mismo tiempo
Detector de arreglo de diodos.
Espectro de 200 a 600 nm en
menos de 1 segundo.
 Cromatografa de fase
reversa
Se basa en las propiedades hidrofbicas de las
protenas.
El proceso de elucin es diferente que en la
cromatografa hidrofbica
La fase mvil es un solvente orgnico
(metanol, 2-propanol o acetonitrilo) acidificado
(TFA, cido fosfrico, actico o
hidroxibutrico).
 Fase estacionaria

Slica acoplada con un derivado alquilsilano.

La longitud de la cadena alquilo puede ser de
C4, C8, C18.
La porosidad
o del soporte es variable y se
recomienda que sea entre 300 a 1000 A
El tamao de las partculas es de 5 a 20 m
 Fase mvil
La acidez de la fase mvil:

Influencia el estado inico de la

protena
Controla la ionizacin de la
superficie silanol
Forma pares inicos con la zona
catinica de la protena
Favorece la exposicin de zonas
hidrofbicas de la protena
Cromatograma de fase reversa
17
a

80
215

40
A

AcN (%)
0

0 20 40

Tiempo de Retencin (min)

 HPLC de Fase Reversa

Separacin eficiente an con

concentraciones altas de protenas
Bajo ruido de fondo
Solventes voltiles
Fcil formulacin de la fase mvil
Reproducibilidad de gradientes.
 Diagrama del sistema
HPLC
Termostato de la columna

Celda Microbore

Columna Celda Analtica

Celda Preparativa

Manejador de muestras Manejador de solvente

HPLC WATERS
modelo antiguo
HPLC WATERS
Cromatgrafo de Gases
 Principales componentes
Gas de acarreo
Controladores de flujo
Inyectores
Columnas
Detectores
Sistema de datos
 Gas de acarreo
Con ciertos tipos de columnas y detectores, se requiere
el uso de un gas de complemento en el detector
(make-up).

El make-up, es un gas de arrastre adicionado al

efluente de la columna antes de que pase al detector.

El sistema del gas portador, por lo general contiene uno

o varios tamices con el objeto de eliminar humedad,
hidrocarburos y oxgeno.

Los caudales utilizados en las columnas empacadas

oscila entre 25 y 90 mL/min y de 1 a 2 mL/min en las
capilares.