Inyectores y columnas

para HPLC
Evaluacin de calidad de los medicamentos
Equipo 5
Flores De La Cruz Edgar Francisco
Hernndez Guillermo Ftima
Jimnez Vsquez Eduardo
Rojas Salgado Jos Luis
Profesor: Francisco Lpez Naranjo

Los componentes bsicos de un cromatgrafo liquido son:

Dispositivo de suministro de eluyentes (bomba y dispositivo de
mezclado de eluyente)
Dispositivo de inyeccin
Conducciones y conexiones
Detector y registrador
columna

Sistemas de inyeccin
Este mtodo es de gran importancia, un mal sistema de
inyeccin puede dar lugar a ensanchamientos de la
banda cromatogrfica que deterioren su eficacia.

Un inyector ideal debe cumplir con las siguientes

caractersticas:
Introducir la muestra en la columna como una banda lo
ms estrecha posible
Ser de fcil manejo
Ser capaz de trabajar a presiones elevadas

 Existen dos tipos de inyectores manuales:

Inyectores de jeringa

Inyectores de vlvula

Inyecciones de jeringa

Ventajas

Desventajas

Facilidad de construccin

Falta de reproducibilidad

Permite sacar todo el partido a la eficacia

ofrecida por la columna

Presin de tamao limitada

Dificultad de manejo

Inyectores de vlvula

Columnas de HPLC
SON DE :
Acero inoxidable ( aunque tambin pueden ser de polmeros o vidrio).

COLUMNA

La columna cromatografa es el elemento fundamental de un HPLC, puesto que es donde se

produce la velocidad diferencial de los solutos que permite su separacin; por lo tanto,
resulta fundamental una correcta eleccin de la columna adecuada para cada separacin ,
ya que con una columna inadecuada o de mala calidad no se obtendrn buenos resultados
aunque se disponga del mejor instrumental.

Tubos de acero inoxidable

Miden entre 5 y 30 cm

Tamaos de las partculas de los

rellenos ms comunes son 3, 5 y 10
m

Dimetro interno de las

columnas es a menudo de 4 a
10 mm

En general se trabaja a temperatura

ambiente la temperatura constante
mejora el cromatograma (horno)

Se encuentra la fase
estacionaria (slice, alumina,
etc)

Columnas analticas

Las columnas ms utilizadas:

1.-10 a 15 cm de largo
2.- 4.6 mm de dimetro interno
3.-empacadas con partculas de 5
m

PRECOLUMNA
Para aumentar la vida de la columna analtica
Se coloca delante una precolumna que elimina la
materia en suspensin y los contaminantes de
los disolventes

Adems, en cromatografa lquido-lquido, la

precolumna sirve para saturar la fase mvil con la
fase estacionaria y as minimizar las prdidas de
sta en la columna analtica

La composicin del relleno de la precolumna

debe ser semejante al de la columna analtica;
sin embargo, el tamao de partcula es por lo
comn mayor para minimizar la cada de presin

precolumnas
Se utilizan dos tipos de precolumnas:
1.-Se utiliza una precolumna entre el reservorio de fase mvil y
el inyector.
-acondiciona la fase mvil
-El disolvente se disuelve parcialmente en el empacamiento de
slice
-asegura que la fase mvil se sature con cido silcico antes de
entrar a la columna analtica

2.- precolumna de proteccin

- posicionada entre el inyector y la columna

analtica.
- es una columna corta empacada con una fase
estacionaria similar a la de la columna analtica.
- previene que impurezas como los compuestos
altamente retenidos y la materia particulada
alcancen y contaminen a la columna analtica.
- sirve para incrementar la vida media de la
columna analtica

1.- la columna contiene una fase estacionaria, en su

mayora de slice que puede realizar ciertas funciones
como:
-superficie absorbente: los grupos activos de la superficie
de la slice o tambin llamados grupos silanol, son
responsables de la separacin.

-actuacin como substrato microporoso: la slice permite la

seleccin de molculas en funcin de su tamao

TIPOS DE
COLUMNA

REVERSA

PARTICION

NORMAL

ABSORCIN
INTERCAMBIO
IONICO
EXCLUSION
AFINIDAD

COMPOSICION
DE FASE MOVIL
DIFERENTE

TIPOSDERELLENODELACOLUMNA
El relleno puede ser de dos tipos de partculas porosas o
pediculares
Los rellenos de partculas porosas para HPLC
estn formados por micro partculas porosas
con dimetros entre 3 y 10 m y con la menor
dispersin
posible
para
un
tamao
determinado. La slice es el material ms
comnmente empleado para este tipo de
columnas, debido a que se pueden producir
partculas con dimetros muy uniformes
El relleno pedicular consiste en bolas de vidrio o de
polmero, no porosas y esfricas con unos
dimetros caractersticos de 30 a 40 m. En la
superficie de estas bolas se deposita una capa
delgada de slice.
El rellenopedicularseutilizaampliamenteenpre
columnasynoparacolumnasanalticas

Partculas
porosas

TAMAO DE PARTICULA: 3-10 m

Tienen un recubrimiento com pelculas
orgnicas unidas fsica o quimicamente

Peculiar:
Puedes ser de vidiro o polmeros:
- no porosas e incluyen un dimetro entre 30 y 40 m Por lo que
generalmente incluyen polietileno y polipropileno.
Comerciales:
-Polystylene (copolmero de estireno-divinilbenceno)
-polimetacrilato
-Polyhydroxymethacrylate
-alcohol polivinlico

Otros:

Columna HPLC de Particin:

Fase normal:
-se trabaja con fase
estacionaria polar y fase
mvil no polar
-se utiliza cuando el
compuesto de inters es
bastante polar

Fase reversa:
Cuando se emplea una
fase estacionaria no polar
y fase mvil polar.

HPLC NORMAL

FASE
ESTACIONARIA(P
OLAR)
slice o almina
( absorbentes de
slice esfrico

FASE
ANALITOS (POLAR)
MOVIL(APOLAR)
Hexano , cloroformo, cianos y aminos.
acetato de etilo,
methylene
chloride, etc.

Relleno/empaquetado:

tiles para la retencin y

la separacin de hidratos -relleno solido absorbente de slice o almina
de carbono.
-La fase estacionaria tiene un tamao de
partcula entre 3 y 10 m. Aunque comnmente
es de 3 a 5 m
-forma esfrica
-tamao de poro se mide en A

HPLC FASE REVERSA

En esta tcnica una mezcla de agua/solvente
orgnico es comnmente usada como fase
mvil, y un slido de rea de superficie
altamente no polar es empleado como fase
estacionaria. La ltima es usualmente un
empaque de alcanos adheridas a slice, por
ejemplo, con grupos alquilo de 8 o 18
carbonos cubriendo la superficie de slice.
RPC (reverse phase chromatography) es
actualmente el mtodo ms popular de
cromatografa en lquidos; mas del 70 % de
todas las separaciones por HPLC son llevadas
a cabo por este mtodo.
Sirve para analizar compuestos tanto inicos
como no inicos

HPLC INVERSA/ REVERSA

FASE ESTACIONARIA
(APOLAR)
-Cadenas hidrocarbonadas o
grupos fenilo
-slice tratada con otros
grupos funcionales como el
octadecilo, cianilo, fenilo,
butilo entre otros.

FASE MOVIL( POLAR)

Agua y acetonitrilo, en
donde el agua es utilizado
en grandes proporciones
con un modificador
orgnico que completa la
composicin del eluyente

ANALITOS
(APOLAR)
para compuestos
como dimetilsililo,
fenilsililo,
octametilsililo, etc.

las aplicaciones de los mtodos de fase inversa se utilizan para preservativos

alimentarios, herbicidas y azcares.

Relleno/empaquetado:
-Relleno es liquido y de dos tipos, uno es una matriz de gel de slice
con cadenas alquilo unidos qumicamente y el otro es base de resina.
( la segunda se utiliza en caso de que el pH de la primera no es
apropiado.
-cuanto mas larga es la cadena alquilo mayor es la fuerza de
retencin.
-el tamao de fase estacionaria con un poro de 30 nm.
- Forma esfrica
- Tamao de partcula es de 5m y 6 para en ocasiones hasta 10 nm

HPLC ADSORCIN:
FASE
ESTACIONA
RIA

FASE
MOVIL

Silica al 90% y disolvente

alumina al 10% apolar (nhexano) unido
a otro ms
activo
(acetona,
cloruro de
metilo, etc.)

ANALITO
S
para
compuestos
como
dimetilsililo,
fenilsililo,
octametilsilil
o, etc.

separacin de compuestos orgnicos neutros (mezclas).

para compuestos no polares con masas inferiores a 5000.

-Se utiliza para molculas no ionizantes o no solubles en agua.

-su fase estacionaria es la superficie de un slido finamente dividido

Columna HPLC de exclusin/permeacin de

gel
-Se basa en la diferencia de tamaos
de molculas a separar

FASE
ESTACIONARIA

FASE
MOVIL

ANALITOS

La fase
estacionaria es un
liquido o
partculas
nanoporosas
(geles de dextrano
y slice).
-largos polmeros
entrecruzados que
forman una red
tridimensional
porosa

Agua,
cloroform
o,
alcoholes
,hexano,
cloroform
oe
isopropan
ol

separacin
de
protenas.
Separacin
de
compuestos
biolgicos
como
protenas y
pptidos.
polmeros

HPLC intercambio inico

La cromatografa de intercambio inico es un mtodo que permite la
separacin de molculas basada en sus propiedades de carga elctrica. Se
compone de dos fases: la fase estacionaria o intercambiador inico, y la fase
mvil.
La fase estacionaria insoluble lleva en la
superficie cargas electrostticas fijas, que
retienen contraiones mviles que pueden
intercambiarse por iones de la fase mvil, la
cual suele ser una disolucin acuosa con
cantidades moderadas de metanol u otro
disolvente orgnico miscible con agua que
contiene especies inicas generalmente en
forma de buffer. Los iones de sta compiten con
los analitos por los sitios activos de la fase
estacionaria.

Columna de intercambio inico

Intercambiadores inicos
Un intercambiador inico es, por lo general, un polmero que tiene grupos cargados unidos.
INTERCAMBIADORES ANINICOS:

INTERCAMBIADOR CATINICO:

Son portadores de grupos con cargas

positivas que unen aniones de forma
reversible. Si el grupo cargado es
positivo, es un intercambiador de
aniones.
Los
intercambiadores
dbilmente bsicos ms corrientes son
los grupos aminos alifticos o aromticos

Son portadores de grupos con carga negativa

que unen cationes de modo reversible. Un
grupo tpico que se utiliza en los
intercambiadores de cationes es el grupo
sulfnico, SO-3. Si se une un H+ al grupo, se
dice que el intercambiador se encuentra en
forma cida y puede, por ejemplo, intercambiar
un H+ por un Na+ o dos H+ por un Ca+2

FASE ESTACIONARIA

FASE MOVIL

arcillas y las ceolitas, as como resinas

solucin
sintticas.
amortiguadora de pH
Contienen grupos cargados, teniendo la
propiedad de separar especies ionizadas
(Cationes o Aniones)

ANALITOS
analizadores
para
aminocidos, frmacos y
sus metabolitos, sueros,
conservantes
de
alimentos, mezclas de
vitaminas, azcares y
preparaciones
farmacuticas.