La clonacin

La palabra clonacin (del griego klon: retoo)

tiene diferentes significados:
En su acepcin ms comn, significa la
obtencin de uno o de varios individuos, bien
sea a partir de una clula (diferenciada o
indiferenciada), o simplemente, a partir de un
ncleo. Los individuos as clonados son
idnticos o casi idnticos al original.
En un sentido ms estricto, dentro del contexto
de la ingeniera gentica, la clonacin consiste
en aislar y amplificar o multiplicar un gen
determinado o de un segmento de ADN,
procedimiento que se lleva a cabo dentro de un
tubo de ensayo (Bren L.2003).

Un clon es una unidad genticamente igual a la

unidad predecesora, de la que est clonado. La
unidad puede ser molecular, clonando un gen,
un grupo de genes, el ADN completo, una
clula, un tejido, un rgano o un individuo
completo. Los clones se producen de forma
natural por divisin asexual.

MTODOS DE
CLONACIN

PARTICIN:

En esta tcnica se utilizan embriones

octocelulares, en estado de preimplantacin.
A partir del embrin seleccionado, se toman
mitades o secciones que posteriormente se
introducen dentro de zonas pelcidas
naturales o artificiales.
A continuacin, se efecta la implantacin del
producto en el endometrio. El nmero mximo
de clulas del embrin, no puede ser superior
a 8, porque a partir de este momento, se
inicia la expresin del genoma embrionario.

 Los

individuos obtenidos
son prcticamente
idnticos entre s, aunque
diferentes a los
progenitores, por lo cual
se considera que son el
equivalente de los
gemelos monocigticos.

CLONACIN POR TRANSFERENCIA

NUCLEAR DE CLULAS
SOMTICAS (SCNT: SOMATIC CELL
NUCLEAR TRANSFER):

los requisitos mnimos para la SCNT incluyen

el uso de dos tipos de clulas: somticas o no
sexuales, y sexuales femeninas, u oocitos.
Los ncleos de clulas somticas de
individuos postnatales se transfieren dentro
de oocitos o de cigotos enucleados.
Esta tcnica tiene la ventaja que permite
conservar
el
genoma
durante
la
diferenciacin celular y la capacidad del
citoplasma celular para reprogramar la
actividad
gnica
y
aumentar
la
redireccionalidad de la diferenciacin
celular. Sin la aplicacin de estos dos
principios, la clonacin no es posible.

Para clonar a un ser vivo mediante SCNT,

se extrae el material gentico de ambos
tipos de clulas y, a continuacin, se
inyecta el ncleo de la clula somtica
que se desea clonar (donante), dentro del
oocito previamente enucleado (receptor).
El transplante de ncleos somticos
dentro de oocitos enucleados tiene como
fin reproducir los procesos bioqumicos y
fisiolgicos que, de manera natural, se
desencadenan durante la fertilizacin.

PARACLONACIN:

Consiste en inyectar ncleos de clulas

madre embrionarias en cultivo, dentro
de oocitos enucleados y, a veces, de
cigotos nucleados. Los blastmeros se
obtienen a partir de varias fuentes
como la masa celular interna o el
trofoectodermo
de
embriones
preimplantados y sus ncleos son
transferidos
dentro
de
oocitos
enucleados.

Los individuos obtenidos son casi

idnticos entre s, aunque diferentes a
los padres del embrin que aport el
ncleo transferido.

Se ha demostrado que la supervivencia de los

clones formados a partir de clulas madre
embrionarias en el instante del nacimiento o
hasta la edad adulta, es 10 a 20 veces mayor
que en los derivados de clulas somticas.
Por otra parte, los clones derivados de clulas
madre
embrionarias
tienen
mejores
posibilidades de reactivar completamente genes
claves para el desarrollo embrionario tales como
oct4 y 10oct4 y as constituir una poblacin de
clulas verdaderamente totipotenciales. Sin
embargo, las clulas madre embrionarias,
aunque requieren un menor grado de
reprogramacin que las clulas somticas,
presentan una elevada inestabilidad epigentica
en cultivos in vitro.

La inestabilidad se refleja en una

expresin aberrante de la huella
gentica, de modo que, cuando estas
clulas se utilizan como donantes para la
clonacin reproductiva, el fenotipo fetal
y placentario de los clones, exhibe
graves patrones de anormalidad. Sin
embargo, cuando se emplean como
fuente de ncleos para la clonacin
teraputica, en apariencia no ocurre
este
error,
pues,
durante
la
reprogramacin, se seleccionan tan slo
las clulas competentes.

CLONACIN CELULAR

Clonar una clula consiste en formar

un grupo de ellas a partir de una sola.
En el caso de organismos unicelulares
como bacterias y levaduras, este
proceso es muy sencillo, y slo
requiere la inoculacin de los
productos adecuados.
Sin embargo, en el caso de cultivos de
clulas en organismos multicelulares,
la clonacin de las clulas es una tarea
difcil, ya que estas clulas necesitan
unas condiciones del medio muy
especficas.

Una tcnica til de cultivo de tejidos

utilizada para clonar distintos linajes de
clulas es el uso de aros de clonacin
(cilindros).
De acuerdo con esta tcnica, una
agrupacin de clulas unicelulares que
han sido expuestas a un agente
mutagnico o a un medicamento utilizado
para propiciar la seleccin se ponen en
una alta dilucin para crear colonias
aisladas; cada una proviniendo de una
sola
clula
potencialmente
y
clnicamente diferenciada.

En una primera etapa de crecimiento,

cuando las colonias tienen slo unas pocas
clulas; se sumergen aros estriles de
poliestireno en grasa, y se ponen sobre una
colonia individual junto con una pequea
cantidad de tripsina.
Las clulas que se clonan, se recolectan
dentro del aro y se llevan a un nuevo
contenedor
para
que
contine
su
crecimiento.

CLONACIN MOLECULAR

La clonacin molecular se refiere al proceso

de aislar una secuencia de ADN de inters,
insertarlo en un plsmido y obtener mltiples
copias
de
ella
en
un
organismo
(generalmente procariota) por accin de la
DNA polimerasa.

La clonacin se emplea frecuentemente

para amplificar fragmentos de ADN que
contienen genes, un paso esencial en el
anlisis subsecuente. Frecuentemente, el
trmino clonacin es errneamente
utilizado para referirse a la identificacin
de una localizacin cromosmica de un
gen asociado con un fenotipo particular
de
inters,
como
en
la
clonacin posicional. En la prctica, la
localizacin de un gen en un cromosoma o
regin genmica no necesariamente
habilita para aislar o amplificar la
secuencia genmica de inters.

PRINCIPIOS DE
CLONACIN
MOLECULAR

UNA FUENTE ADECUADA DE ADN:

Las fuentes ms importantes de ADN para

clonacin
son
el
ADN
genmico
(cromosmico) que contiene los genes
completos y lo que se conoce como ADN
complementario (ADNc) que se obtiene a
partir del ARN mensajero (ARNm) bajo la
accin de la enzima transcriptasa reversa o
transcriptasa inversa. Esta enzima es capaz
de sintetizar ADN a partir del ARN el cual le
sirve como molde. El empleo de una u otra
fuente depende de los objetivos que se
persigan con el estudio a realizar.

VECTORES DE CLONACIN (ADN

RECOMBINANTE):

Un vector de clonacin es una molcula pequea

de ADN que puede replicarse de manera
autnoma en un husped (clulas bacterianas o
de levaduras), a partir de las cuales es posible
aislarlo en forma pura para el anlisis. Los
vectores se utilizan para clonacin porque
pueden seguir su desarrollo normal a pesar de
que secuencias adicionales de ADN sean
incorporadas en su material gentico; se
autorreplican utilizando la maquinaria enzimtica
de la clula husped, y en este proceso, no se
mezclan con el ADN genmico de la clula

Debido a que los vectores de clonacin

pueden generar un gran nmero de copias
por clula, ya que los huspedes bacterianos
o
de
levaduras
pueden
crecer
indefinidamente en el laboratorio, es posible
obtener grandes cantidades de secuencias
del ADN de inters. Cierto nmero de
vectores se utiliza de modo comn para este
propsito, cada uno con ventajas y
limitaciones.

Dentro

de ellos tenemos:

PLSMIDOS:

Son molculas circulares de ADN de doble

cadena
que
se
replican
de
modo
extracromosmico en bacterias, o menos
comnmente en levaduras (Lehninger, 1993;
Ministerio de Educacin, 1981). En ellos se
encuentran genes que le confieren al
organismo que los posee resistencia a
algunos antibiticos, as como genes
involucrados en la produccin de toxinas y la
degradacin de productos naturales.

BACTERIFAGOS:

Son virus que infectan a las bacterias y

estn constituidos, segn su clase, por un
ncleo de ADN o ARN y una cubierta
proteica; algunos presentan una cola, y
son
incapaces
de
replicarse
autnomamente por lo que necesitan
infectar a la clula para poder hacerlo.
Dentro de los fagos ms utilizados como
vehculos moleculares de clonacin, se
encuentran el lambda () y sus
derivados.

CSMIDOS:

Son bsicamente plsmidos que

emplean la habilidad de las
partculas
infecciosas
del
bacterifago para "empaquetar"
de manera eficiente grandes piezas
lineales de ADN e introducirlas en las
clulas bacterianas. Estos vectores
se reproducen de igual manera que
los plsmidos en las bacterias.

"CROMOSOMAS ARTIFICIALES"
DE LEVADURA:

Adems de los vectores anteriormente

mencionados, existe otro tipo que
permite clonar hebras de ADN de gran
tamao y que se conocen como
cromosomas artificiales de levadura (YAC,
del ingls yeast artificial chromosome).
Este tipo de vector es capaz de replicarse
en el husped Saccharomyces cerevisiae
(levadura comn usada en panadera) y
tiene la estructura semejante a los
cromosomas de levadura normales.

ENZIMAS QUE PERMITAN LA ESCISIN O CORTE EN

SITIOS ESPECFICOS DEL FRAGMENTO DE ADN A
CLONAR Y SU POSTERIOR FUSIN CON EL VECTOR:

Existe un grupo de enzimas

con funciones diferentes que
tienen gran aplicacin en
ingeniera gentica.

ENDONUCLEASAS DE
RESTRICCIN

son enzimas que cortan al ADN en secuencias

especficas dentro de la molcula (contrario a las
exonucleasas, que digieren a las molculas de
ADN por sus extremos). Estas enzimas se
encuentran en una amplia variedad de especies
bacterianas y su funcin biolgica consiste en
reconocer y romper el ADN ajeno que puede
penetrar en la clula (por ejemplo, ADN
procedente de bacterifagos). De esta forma
estas endonucleasas restringen el funcionamiento
de los fagos en el interior de la bacteria, motivo
por el cual originalmente se les llam enzimas de
restriccin.

ADN LIGASA:

La ADN ligasa es una enzima que tiene la

capacidad de formar enlaces fosfodister en
una cadena de ADN rota, pudiendo unir
covalentemente ADNs de diferentes orgenes
para formar molculas hbridas. Existen
diversos mtodos en los que se aprovecha la
accin de esta enzima para la unin del
fragmento a clonar con el vector; la
seleccin de uno u otro depende de las
caractersticas de los extremos de ambas
molculas de ADN.

LA CLONACIN DE CUALQUIER
SECUENCIA DE ADN INCLUYE
LOS SIGUIENTES PASOS:

FRAGMENTACIN:

Inicialmente: el ADN de inters

necesita ser fragmentado para proveer
un segmento relevante de ADN de un
buen tamao. La preparacin de los
fragmentos para la clonacin se
obtiene frecuentemente del PCR, pero
tambin puede hacerse por medio de
la digestin con enzimas de restriccin
y
a
veces
fraccionando
con
electroforesis en gel.

LIGACIN:

Un procedimiento de ligacin se
emplea cuando el fragmento
amplificado se inserta en un vector.
Dicho vector (que generalmente es
circular) se convierte en una secuencia
lineal utilizando enzimas de
restriccin, y es incubado con el
fragmento de inters bajo las
condiciones apropiadas con una enzima
llamada ADN ligasa.

LIGACIN:

TRANSFECCIN:

Despus de la ligacin, el
vector con el gen de inters
se transfecta a una clula.
Comnmente se utiliza la
electroporacin,
aunque
existe un gran nmero de
tcnicas alternativas.

SELECCIN:
Las

clulas transfectadas se
cultivan.
Como
este
procedimiento actualmente se
considera de baja eficiencia, se
deben identificar las colonias de
clulas que han sido exitosamente
transfectadas con el vector que
contiene el gen deseado.

APLICACIONES DE LA CLONACIN
MEDIANTE LA TCNICA DE
TRANSFERENCIA NUCLEAR

El estado del arte en la clonacin ha

permitido su empleo en dos direcciones
claramente definidas: La clonacin con
fines reproductivos y la clonacin con
fines teraputicos. La primera apunta a
duplicar
seres
vivos
completos,
mientras que la segunda promete
convertirse en una alternativa para
prevenir y tratar ciertas enfermedades,
as como para el reemplazo de tejidos
y rganos lesionados).

CLONACIN TERAPUTICA

Las clulas madre o troncales

son pues clulas pluripotenciales
de gran tamao que, despus de
experimentar un proceso de
diferenciacin, se especializan
en una direccin funcional
determinada, hacia una gran
variedad de tipos celulares.

LAS CLULAS MADRE SE

PUEDEN OBTENER EN DOS
FORMAS

A PARTIR DE CLULAS DE LA MASA

CELULAR INTERNA O DEL
TROFOECTODERMO DE BLASTOCISTOS
CLONADOS MEDIANTE LA TCNICA DE
TRANSFERENCIA NUCLEAR Y
CULTIVADAS IN VITRO.

A las clulas somticas donantes se las

manipula para inducirlas a un proceso de
diferenciacin en tipos celulares determinados,
que posteriormente se utilizarn en el
tratamiento de ciertas enfermedades
incurables.

LA VENTAJA

Radica en que las clulas madre

embrionarias,
una
vez
transplantadas, no provocan
rechazo inmunolgico, pues se
comportan
como
injertos
autlogos, gracias a que son
genticamente idnticas a las
clulas del receptor o del
paciente.

EL PROBLEMA DE LOS
TRANSPLANTES HETERLOGOS

Es el largo tiempo que toma el enfermo

en aceptarlos, a pesar de que los rganos
utilizados
comparten
su
misma
informacin gentica, pues casi siempre
provienen de miembros de la misma
familia. Por otra parte, cuando se
produce rechazo al tejido transplantado,
la salud del individuo queda seriamente
comprometida y hay la eventualidad que
se debe pensar en un nuevo transplante.

Los defensores de la clonacin

teraputica
de
clulas
humanas aducen que permite
disponer de tejidos y de
rganos viables, a partir de
una fuente de ADN, sin que sea
necesario traer un nuevo ser al
mundo con el nico fin de
obtener un tejido.

DE CLULAS PLURIPOTENCIALES DE
LA SANGRE DEL CORDN UMBILICAL

La muestra de sangre se obtiene en el

momento del nacimiento, sin que el neonato ni
su madre se vean afectados.
La eficiencia del procedimiento es tal, que, a
partir de un volumen de 20 ml de sangre del
cordn, se obtienen hasta 4 millones de clulas
madre, que pueden crioconservarse por largo
tiempo sin deterioro alguno, para ser utilizadas
en transplantes y en procesos de terapia
gnica.

La sangre del cordn umbilical tambin

provee hemates normales y leucocitos
muy tiles en el tratamiento de la
anemia falciforme y en la restauracin
del sistema inmunitario de los nios
nacidos con inmunodeficiencia grave.
Si las clulas madre que provienen de
determinados rganos de individuos
adultos, se cultivan en condiciones
apropiadas, son susceptibles de sufrir
transdiferenciacin.

CLONACIN REPRODUCTIVA:

Inicialmente, el proceso es igual al

que se efecta durante la clonacin
teraputica. La diferencia aparece
con posterioridad a la fusin del
ncleo de la clula donante con el
oocito enucleado, pues el cigoto se
debe implantar en un tero, donde
se desarrollar hasta formar un
individuo rplica del donante.

Dicen sus defensores, que esta tcnica podra

ser una alternativa para las parejas infrtiles o,
para las que tienen hijos con enfermedades
genticas o, que potencialmente podran
engendrarlos.
Los detractores consideran que es un
procedimiento "biolgicamente incierto" debido
al poco xito alcanzado en la clonacin de
primates no humanos, pues tendran que
fertilizarse muchas madres sustitutas con el fin
de obtener un solo nacimiento exitoso. Adems,
la necesidad mdica para efectuar una
clonacin reproductiva es mnima, si se tiene en
cuenta el porcentaje relativamente bajo (1%)
de parejas infrtiles.

TCNICAS DE
MANIPULACIN
GENMICA EN ANIMALES

 Las

principales tcnicas
de manipulacin
genmica en animales
hoy por hoy son:

TRANSGNESIS:

El
significado
de
la
palabra
Transgnesis o trasferencia de genes
mediante tcnicas artifcales o de
laboratorio,
contemplan
la
incorporacin de un gen extrao, es
decir proveniente de otra especie en el
genoma de un individuo. En un animal
transgnico ideal el gen aadido es
funcional y puede heredarse de una
generacin a otra de manera normal.

EL OBJETIVO DE LA
TRANSFERENCIA DE GENES

Es que el animal produzca una protena o

adquiera un fenotipo que normalmente no
manifiesta. En tiempos ms recientes se
han desarrollado varias tcnicas que
permiten la transferencia de genes de una
especie a otra. Una de las ms utilizadas
es la llevada a cabo mediante la
microinyeccin directa de genes (ADN)
dentro del proncleo del embrin en el
estadio temprano (una sola clula).

MICROINYECCIN DEL ADN EN EL

PRONCLEO DEL OVOCITO FECUNDADO Y
EN CLULAS EMBRIONARIAS

MICROINYECCIN DEL ADN

MUTAGNESIS DIRIGIDA

El termino de Mutagnesis
dirigida se refiere al hecho de
modificar
la
estructura
molecular de un gen especifico
en
clulas
embrionarias
indiferenciadas (Clulas ES) o en
clulas somticas ya sea fetales
o
de
individuos
adultos
cultivadas in vitro.

El ncleo de estas clulas

modificadas
(transgnicas)
puede ser trasferido a
ovocitos maduros enucleados
y, como
resultado
del
trasplante
nuclear,
se
obtiene un animal con una
mutacin determinada.

VENTAJAS

Brindar la oportunidad de conocer el

funcionamiento de un gen en particular
en el animal completo ( Durante el
desarrollo o en el adulto).
Brinda la posibilidad de producir animales
que pueden servir como modelos de
enfermedades humanas y, por lo tanto,
pueden ser utilizados para desarrollar
estrategias teraputicas para combatirlas.

MICROINYECCIN PRONCLEAR Y MUTAGNESIS

DIRIGIDA.

LA CLONACIN
ANIMAL

Durante siglos se ha buscado la

mejora de razas en el ganado,
seleccionando individuos con
ms
carne
y
mejores
productores de leche o lana. La
forma de conseguir estos nuevos
individuos ha sido mediante
cruzamiento de parentales con
las caractersticas deseadas,
aunque esto no siempre se ha
logrado.

En la actualidad se utiliza la
clonacin de organismos para
obtener individuos
genticamente modificados,
conocidos por el pblico no
cientfico como transgnicos. Se
busca conseguir aislar los genes
responsables del engorde, de la
produccin de leche, de la
resistencia a infecciones, etc.

La tcnica en animales consiste en

conseguir clulas que contengan el gen
responsable de la caracterstica deseada.
Posteriormente, el ncleo de esa clula
es insertado en un ovocito, del que
previamente se ha extrado su ncleo.
Despus hay que conseguir que esa clula
diploide se divida formando un nuevo
individuo, tal como lo hara un cigoto
formado por la fecundacin del vulo por
el espermatozoide. Finalmente, para que
desarrolle este embrin, hay que
implantarlo en el tero de una hembra.

Se puede modificar genticamente

el ncleo de la clula de un animal
para, posteriormente, clonarlo. En
este caso, al ovocito al que se le ha
extrado el ncleo se le inyecta el
ncleo con la informacin gentica
modificada.

PROBLEMAS QUE
PLANTEA LA
CLONACIN

LA CLONACIN
MOLECULAR GENERA
DISTINTOS TIPOS DE
PROBLEMAS,
DEPENDIENDO DEL
MTODO EMPLEADO

Para poder realizar la clonacin celular

de molculas es necesario realizar los
siguientes pasos:
Conocer la secuencia de ADN que se
quiere clonar.
Escoger un vector con suficiente eficacia
como para insertar la secuencia de ADN.
Encontrar las clulas que han sido
recombinadas por el vector.
Recoger el producto codificado por el ser
clonado.

Hay que obtener clulas troncales: que se

obtienen de:
Clulas generadoras de tejidos concretos, denominadas
clulas comprometidas o multipotentes, como las
clulas que generan las clulas sanguneas, en la mdula
sea.
Clulas totipotentes, capaces de originar todo tejido de
cualquier estirpe celular. Este tipo de clulas slo se
pueden obtener de los primeros estadios de divisin
celular en el desarrollo embrionario. Las clulas, a las
que nos estamos refiriendo, son los blastmeros, que
aparecen por segmentacin del zigoto. Para poder
utilizarlas se necesita trabajar con embriones. Este
trabajo se puede realizar con clulas de animales, pero
no humanos, ya que la ley actual no permite la
utilizacin de embriones humanos.

LA CLONACIN DE
ORGANISMOS
GENTICAMENTE
MODIFICADOS PLANTEA DOS
TIPOS DE PROBLEMAS

UN PROBLEMA SOCIAL:

se ha promovido un rechazo a
los organismos "transgnicos",
puesto que se desconoce la
influencia que puede acarrear el
cambio gentico en ese ser en el
medio ambiente y en el
consumidor.

PROBLEMAS TCNICOS

la tcnica es todava
demasiado reciente. Estos
problemas tcnicos son
mayores en la clonacin
de animales que en la de
vegetales.

TICA DE LA
CLONACIN

Cada individuo tiene una opinin

acerca de si es o no correcto
clonar a otro ser humano. La idea
de producir asexualmente copias
mltiples de organismos idnticos
desde un punto de vista gentico,
todos
descendientes
de
un
antecesor comn, crea, en la
mayora de las personas, una
reaccin moral negativa.

HAY MOTIVOS SERIOS Y NO SERIOS, POR LOS QUE LA

GENTE PIENSA QUE SE DEBE RECURRIR A LA CLONACIN:

Porque ofrece una esperanza para

dar hijos a las parejas estriles.
Para dar un hijo sano a parejas
afectadas por patologas
hereditarias, incluyendo la
azoospermia, es decir, para que los
hijos puedan generar hijos.

Para procurar un hijo de un genotipo

determinado.
Para predeterminar el sexo de los hijos
que nacern. El sexo del hijo clonado es
el mismo del sujeto que don el ncleo
transplantado.
Para mejorar las tcnicas de FIVET y los
porcentajes de xito en la reproduccin.
Para el diagnstico de pre-implanto, en
favor del embrin original.
Para replicar individuos muy dotados,
admirados, amados.

Para producir parejas embrionales de cada

persona, que se conserven congeladas y
puedan ser utilizadas en caso de necesidad
como reservas de rganos para
transplantes.
Para fines experimentales por explorar.
Para fabricar grandes cantidades de sujetos
genticamente idnticos que permitan la
conduccin de estudios cientficos sobre la
importancia de la naturaleza innata y del
ambiente, respeto a distintos aspectos de las
prestaciones humanas, en la estructuracin
de la personalidad, o sea, para fines de
experimentacin con humanos.

Para ganar las olimpiadas y las

competencias atlticas.
Para producir sujetos que
puedan cumplir tareas
especificas en tiempos de guerra
y de paz.
Para satisfacer la curiosidad
humana, que desea
experimentar nuevas
posibilidades.