CROMATOGRAFA

Mikhail Tswett, 1906

Separacin de pigmentos vegetales usando
una columna de carbonato clcico

CROMATOGRAFA
Separacin
de
los
componentes de una mezcla
(muestra), disueltos en una
fase mvil a medida que se
van
desplazando
con
diferente velocidad a travs
de una fase estacionaria

TIPOS DE CROMATOGRAFAS
ESTADO FSICO DE LAS FASES:
Fase Mvil
- Gaseosa (Cromatografa de gases)
- Lquida (Cromatografa Lquida)
Fase Estacionaria
- Lquida (inmovilizada, soporte)
- Slida

TIPOS DE CROMATOGRAFAS
CRITERIOS DE SEPARACIN:
1. REPARTO (F. estacionaria lquida)
Los componentes de la mezcla se reparten entre las
fases mvil y estacionaria en funcin de sus
caractersticas. La composicin de la fase mvil es
constante.

2. ADSORCIN (F. estacionaria slida)

Los componentes de la mezcla quedan retenidos sobre
la superficie de la fase estacionaria y hay que cambiar
la composicin de la fase mvil para eluirlos.

CROMATOGRAFA DE REPARTO
1.SOLUBILIDAD
Fase Normal: F. Estacionaria polar, F. Mvil
apolar
Fase Reversa: F. Estacionaria apolar, F. Mvil
polar
2. TAMAO (exclusin molecular)
Fases mvil y estacionaria lquidas idnticas
separadas por una especie de tamiz o malla

CROMATOGRAFA DE
ADSORCIN
1. INTERCAMBIO INICO
Fase estacionaria positiva: Intercambio aninico
Fase estacionaria negativa: Intercambio catinico
2. INTERACCIN HIDROFBICA
Fase estacionaria hidrofbica
3. CROMATOGRAFA DE AFINIDAD BIOLGICA
Fase estacionaria con ligandos inmovilizados
4. ADSORCIN INESPECFICA
hidroxiapatita, colorantes inmovilizados

TIPOS DE CROMATOGRAFA
Reparto

Interaccin

Tipo de
interaccin/reparto

Tipo de cromatografa

Solubilidad

Fase Normal
Fase Reversa

Tamao

Exclusin Molecular

Electrosttica

Intercambio aninico
Intercambio catinico

Hidrofbica
Afinidad biolgica

Ligandos
inmovilizados
Inmunoafinidad

Afinidad
inespecfica

Hidroxiapatita
Colorantes

FORMATO

1. COLUMNA
2. BATCH o
TANDAS
- Sistemas manuales
- Equipos automatizados
(HPLC)

3. SUPERFICIES
PLANAS
- Papel
- Capa fina
(TLC, thin layer
chromatography)

TERMINOLOGA
FASE ESTACIONARIA: (matriz, soporte cromatogrfico)
componente esttico de la cromatografa
FASE MVIL: (eluyente) solvente que arrastra a travs
de la columna los componentes de la mezcla a analizar
ELUCIN: paso de fase mvil a travs de una columna
hasta lograr la salida de los solutos
ELUIDO: fase mvil que se recoge a la salida de una
columna

TERMINOLOGA
CROMATOGRAMA: Perfil cromatogrfico, Perfil de
elucin. Representacin grfica de la cuantificacin de
solutos en el eludo de una columna
VOLUMEN DE ELUCIN: volumen de fase mvil que pasa
a travs de la columna hasta que sale cada soluto
VOLUMEN MUERTO: volumen de elucin de una
molcula que viaja a travs de la columna con la
velocidad de la fase mvil, que no experimenta ningn
retraso. Tambin se llama VOLUMEN DE EXCLUSIN

CROMATOGRAFIA EN COLUMNA
Registrador

Solventes

Bomba(s)

Mezclador

COLUMNA

(fase mvil)

Detector
(UV)

Inyector
Colector de
fracciones

HPLC:
High Performance Liquid
Chromatography

Waters, Millipore

Perceptive BioSystems, BioCAD

SEPARACIN DE AMINOCIDOS
MEDIANTE HPLC

CROMATOGRAFIA EN COLUMNA
(manual)

SEPARACIN DE COMPONENTES
CELULARES POR ULTRACENTRIFUGACIN

ELIMINACIN DE MOLCULAS PEQUEAS

MEDIANTE DILISIS

CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN MOLECULAR

CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN MOLECULAR

Volumen de lquido

Volumen de lquido
en las partculas

(Vi)

Volumen ocupado
por la matriz

(Vg)

VT = Vo+ Vi + Vg
Volumen total
de lquido (Vt)

2.0

Absorbancia (280 nm)

(Vo)

en los intersticios

0.0
20

40

60

80 100 120

Volumen de elucin (ml)

Flujo isocrtico, condiciones nativas o desnaturalizantes

CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN MOLECULAR

Nombre comercial

Tipo de matriz

Rango tamao

Sephadex G-50
Sephadex G-100
Sephacryl S-200 HR

dextran
dextran
dextran

1500 - 30000
4000 - 150000
5000 - 250000

Ultrogel AcA 54
Ultrogel AcA 44
Ultrogel AcA 34

polyacrylamide/agarose 6000 - 70000

polyacrylamide/agarose 12000 - 130000
polyacrylamide/agarose 20000 - 400000

Bio-Gel P-60
Bio Gel P-150
Bio-Gel P-300

polyacrylamide
polyacrylamide
polyacrylamide

3000 - 60000
15000 - 150000
60000 - 400000

CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN MOLECULAR:

Estimacin de masas moleculares
Marcadores de masa molecular
2.0

A280 nm

2.0

0.0

14 kD

43 kD

20

40

60

80

100

120

100

120

Protena problema

20

40

60

80

Volumen de elucin (ml)

Volumen de elucin (ml)

A280 nm

67 kD

0.0

Recta de calibrado

25 kD

Log Mr

CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN MOLECULAR

VENTAJAS:
Flexibilidad en cuanto a solvente
Condiciones poco agresivas
Proporciona informacin estructural
INCONVENIENTES:
Poco resolutiva, debido a difusin
La muestra se diluye
Es necesario aplicar volmenes muy pequeos
Etapas finales de protocolos de purificacin

CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN MOLECULAR:

Columnas de desalado
2.0

0.3 kD

120 kD

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.

1.2

Volumen de elucin (ml)

Cambio de solvente
Purificacin de fragmentos de DNA marcados
(fragmento 200 pb: 120 kD; nucletidos libres: aprox. 0.3 kD

INTERCAMBIO INICO

INTERCAMBIADORES INICOS
FASE ESTACIONARIA: SOPORTE GRUPO CARGADO
SOPORTES:
RESINAS SINTTICAS. (P.ej. Poliestireno)
- Densidad muy alta de grupos
intercambiadores
- Muy hidrofbicas: desnaturalizacin
de biomolculas
- Eliminacin de impurezas inicas de
solventes qumicos y de tampones
Purificacin de agua
POLMEROS NATURALES. Celulosa, agarosa

INTERCAMBIADORES INICOS

INTERCAMBIADORES INICOS
Intercambiador

Tipo
Fuerte

Grupo cargado

CH2CH3

-CH2CH2-N-CH2CH(OH)CH3

Abreviatura
QAE

Dietil-2-hidroxipropilamino
CH2CH3
etilo

De aniones
Dbil

CH2CH3

-CH2CH2-N-H

DEAE

CH CH

3
Dietilamino 2etilo

Fuerte

-CH2CH2-CH2-SO3

Sulfo propilo

De cationes
Dbil

-CH2-COO3

Carboxi metilo

SP
CM

INTERCAMBIADORES INICOS
+
aninico
dbil
(DEAE)

carga

aninico
fuerte
(QAE)
pH

catinico
fuerte
(SP)

catinico
dbil
(CM)

INTERCAMBIO INICO
Matriz(-). In(+) + Soluto(+)

K=

Matriz(-) . Soluto(+) + In(+)

[Matriz(-) . Soluto(+)] [In(+)]

[Matriz(-) . In(+)] [Soluto(+)]

CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO
INICO
1. Equilibrado. Ajuste a
condiciones iniciales
2. Adsorcin. Baja fuerza inica.
Intercambio aninico,
pH >pI
Intercambio
catinico, pH < pI
3. Lavado. Condiciones iguales a
la adsorcin.
4. Elucin. Modificacin de la
fase mvil: aumento de fuerza
inica

pH
pI

INTERCAMBIO INICO
GRADIENTE DISCONTINUO
0.5

Absorbancia (280 nm)

2.0

[NaCl]
(M)
----

0.0

0.0
20

40

60

Nmero de fraccin

80

100

120

INTERCAMBIO INICO
GRADIENTE LINEAL
0.5

Absorbancia (280 nm)

2.0

[NaCl]
(M)
----

0.0

0.0
20

40

60

Nmero de fraccin

80

100

120

CROMATOGRAFA DE INTERACCIN
HIDROFBICA
1.0

Absorbancia (280 nm)

2.0

[Sal]
(M)
- - --

0.0

0.0

Fenil-sefarosa

Octil-sefarosa

20

40

60

80

Nmero de fraccin

100

120

CROMATOGRAFA DE INTERACCIN
HIDROFBICA

Capacidad de facilitar interacciones hidrofbicas

(PO4)3- > (SO4)2- > Acetato > Cl- > Br- > SCN(NH4)+ > K+ > Na+ > Mg2+ > Ca2+

FORMATO

1. COLUMNA
2. BATCH o
TANDAS
- Sistemas manuales
- Equipos automatizados
(HPLC)

3. SUPERFICIES
PLANAS
- Papel
- Capa fina
(TLC, thin layer
chromatography)

CROMATOGRAFA SOBRE SUPERFICIES PLANAS

- Papel
- Capa fina
(TLC, thin layer
chromatography)

CROMATOGRAFA EN PAPEL

- Fase estacionaria: H2O retenida entre las

fibras de celulosa del papel
- Fase mvil: Solvente orgnico (mezcla)
Cromatografa de reparto, fase normal

CROMATOGRAFA EN PAPEL

Aplicacin de la muestra:

Desarrollo de la cromatografa:

volumen mnimo
Extremo

sumergido en la fase mvil, sin tocar el punto de aplicacin de

la muestra.

Recipiente cerrado hermticamente.

Ascendente/descendente

Deteccin de las sustancias separadas:

Directa (sustancias coloreadas o fluorescentes)
Tincin
Autorradiografa (compuestos radiactivos)

CROMATOGRAFA EN CAPA FINA

Optimizacin de cromatografa en papel

Fase estacionaria:

fina capa (0.15-0.5 mm) de

slido pulverizado sobre una superficie de vidrio, plstico o

cristal.

Celulosa, poliamida, almina, slica-gel

VENTAJAS DE LA TLC
Caracterstica

Fase estacionaria
finamente dividida

Ausencia de
estructura fibrosa

Efecto

Ventaja

Elevada accin capilar

Rapidez de
desarrollo

Elevada superficie de
contacto f. mvil f.
estacionaria
Reducida dispersin de
los solutos durante
aplicacin y desarrollo

Vlida cualquier fase

estacionaria que pueda
ser pulverizada

Eficiencia
cromatogrfica
Sensibilidad

Versatilidad

MTODOS DE TINCIN EN TLC

Mtodo

Aplicacin

Color

Inespecfic
o

Vapores de Iodo

C. orgnicos

Pardo-amarillento

H2SO4 + calor

C. orgnicos

Negro
(carbonizacin)

Especfico

2,4dinitrofenilhidraci
na

C.
carbonlicos

Naranja

AgNO3/OH-

C.
carbonlicos

Marrn

cido
iodoplatnico

Bases

Prpura-negro

Verde de
bromocresol

cidos

Verde-amarillento

Ninhidrina

Aminas 1rias
(aminocidos
)

Azul-violceo

Rodamina 6G

Lpidos

fluorescencia

FACTOR DE RETARDO (Rf)

Frente del
solvente
soluto

Rf =

origen

Distancia migrada por el soluto

Distancia migrada por el frente

TLC BIDIMENSIONAL

1 dimensin

2 dimensin

punto de
aplicacin

CROMATOGRAFA DE AFINIDAD

+ glucose

CROMATOGRAFA DE AFINIDAD
1. Equilibrado. Ajuste a condiciones

2.0

2. Adsorcin. Alta fuerza inica.

3. Lavado. Condiciones iguales a la
adsorcin.

4. Elucin.
Competicin con ligando libre

Absorbancia (280 nm)

iniciales.
Adicin de
ligando libre

Desnaturalizacin (pH,
temperatura, agentes caotrpicos)
0.0
20

40

60

80

Nmero de fraccin

100

LIGANDOS PARA CROMATOGRAFA DE AFINIDAD

CROMATOGRAFA DE AFINIDAD:
PREPARACIN DE LA FASE ESTACIONARIA
1. Activacin del soporte
2. Anclaje covalente del ligando
3. Bloqueo de grupos reactivos
remanentes

+ CNBr

OH

C=N
O

+ NH2-ligando

agarosa

OH
agarosa

agarosa

NH

O-C-NH-ligando

OH

PROTENAS DE FUSIN RECOMBINANTES

CROMATOGRAFA DE AFINIDAD

INMUNOPRECIPITACIN

INMUNOPRECIPITACIN