DEGRADACION DE

COMPUESTOS XENOBIOTICOS
(PLAGICIDAS)
PRESENTADO POR:
LAURA JOHANA FUENTES TORRES
NELCY NAVARRO ESTEVEZ
ESNEYDER PINTO CASTAEDA
JUAN SEBASTIAN TIBADUIZA BERMUDEZ
ANDRES FERNANDO MUNEVAR CORONADO

DEGRADACION DEL ALDRIN POR

Bacillus licheniformis, AISLADO DEL
AGUA Y SEDIMENTO DE LA CIENAGA
GRANDE DE SANTA MARTA, COLOMBIA
JOS GREGORIO SNCHEZ DAZGRANADOS1 Especialista en Ciencias Ambientales;
CARLOS ANDRS HENRY LPEZ1 Especialista en Ciencias Ambientales. 1 Instituto
de Investigaciones Marinas y Costeras Jos Benito Vives de Andreis-Invemar.
Punta
Betn,
Santa
Marta,
Magdalena,
Colombia.
A.A.
1016.
jsanchez@invemar.org.co

INTRODUCCION

El uso inadecuado de contaminantes orgnicos persistentes, como los plaguicidas

organoclorados, el desconocimiento de efectos colaterales, la falta de informacin
sobre sus caractersticas sobre el ambiente y la ausencia de polticas claras sobre sus
aplicaciones en pases en va desarrollo, han contribuido a alteraciones de los
ecosistemas y aumento del factor de riesgo para los seres vivos por lo cual se hace
necesario la implementacin de planes de manejo para su uso y aplicacin (Atlas y
Bartha, 2001).

Los efectos sobre la salud humana producidas por los plaguicidas dependen de la dosis,
va de administracin y tiempo de exposicin. Los efectos agudos (vmitos, diarrea,
aborto, cefalea, somnolencia, alteraciones comportamentales, convulsiones)

METODOLOGIA
1.
2.
3.
4.

TOMA DE MUESTRA
AISLAMIENTO DE Bacillus licheniformis
COMPORTAMIENTO DE Bacillus licheniformis FRENTE ALDRIN
FASE DE LABORATORIO DE QUIMICA

Img. 1 ALDRIN plaguicida

Img. 2 Bacillus licheniformis

TOMA DE MUESTRA

Figura 1. Estaciones de muestreo.

AISLAMIENTO DE Bacillus licheniformis

A 150 g de sedimento se le adicionaron 100 mL de agua de la misma estacin en
frascos estriles, agitando en shaeker orbital a 180 rpm durante 12 horas y
dejando decantar por el mismo tiempo cada muestra. Se sembraron las muestras
por duplicado en diluciones de 101 hasta 105 en agar nutritivo con una
concentracin de aldrn de 60 ng/L (ANA60), luego se incubaron a 30 C durante
2 4 das para recuento total de microorganismos

Se sembraron las cepas de B. licheniformis en caldo nutritivo durante 48

horas a 30 C y se determin el nmero de clulas por recuento en placa y la
absorbancia de estas, a una longitud de 540 nm, en un espectrofotmetro
Perkin Elmer UV/Visible Lambda 12, estableciendo una concentracin
alrededor de 106 clulas. Cada cepa se sembr en caldo nutritivo durante 48
horas a 30 C, luego se centrifug a 2000 rpm x 30 minutos, se desech el
sobrenadante y del precipitado se transfirieron 50 mL a un frasco Schott
estril de 500 mL completando el volumen con medio de sales mnimas, el
cual contena NaCL 0,8 g/L, NH4CL 1 g/L, KCL 0,1 g/L, KH2PO4 0,1 g/L,
MgSO4.7 H2O 0,2 g/L, CaCL2.2 H2O 0,04 g/l, melaza 5g/L y una
concentracin de aldrn de 60 ng/L (Gmez, 2003),

COMPORTAMIENTO DE Bacillus licheniformis FRENTE

ALDRIN

En esta etapa se observ el comportamiento de B. licheniformis

frente a una concentracin de 60 ng/L de aldrn. Se realiz un
blanco reactivo por triplicado (500 mL de medio de sales mnimas
ms 60 ng/L de aldrn). Se tomaron muestras por duplicado a los
tratamientos para recuento de clulas viables por el mtodo de
siembra en placa en ANA60 los das 0, 15, 30 del perodo de
incubacin y la cuantificacin de las concentraciones de aldrn.

FASE DE LABORATORIO DE QUIMICA

La extraccin de los residuos de plaguicidas organoclorados de las muestras
provenientes de los ensayos, se realizaron por medio del mtodo UNESCO, 1984
extraccin lquido -lquido, cromatografa de gases ECD. El mtodo se fundamenta en
la extraccin sucesiva con mezclas de hexano-ter.
a) Cada dtratamiento se traspas a un embudo de separacin e 2000 mL, al cual se
le adicionaron 50 mL de hexano-ter 15%

b) Se agit vigorosamente durante 3 minutos, dejando reposar por 1

minuto, se separaron las dos fases, el sobrenadante se recogi en un
erlenmeyer de 250 mL (primera extraccin).
c) La fase acuosa se traspas nuevamente al embudo de separacin
adicionndole 50 mL de solucin de hexano-ter a 6%; agitando
vigorosamente por 3 minutos y el sobrenadante se recogi en el
erlenmeyer (segunda extraccin).

RESULTADOS
IDENTIFICACIN B. LICHENIFORMIS Se obtuvieron 52 cepas bacterianas de los sedimentos y aguas de las
estaciones de muestreo de la CGSM.
FASE II. COMPORTAMIENTO DE B. LICHENIFORMIS FRENTE AL ALDRN

FIG.1 Figura 2. Cromatograma esquematizando el patrn de aldrn y dieldrn. En el

eje de las abcisas: tiempo de retencin (minutos) y eje de las ordenadas:
respuesta (mV).

Tabla 1. Caractersticas morfomtricas de las cepas tolerantes a 60 ng/L de aldrn. (51.4ng/l)

Tabla 2. Promedio de recuento en placa (UFC) B. licheniformis durante el perodo de incubacin

(24%).

DISCUSIN
IDENTIFICACIN B. LICHENIFORMIS

Figura 3. A. Degradacin bitica /abitica y abitica del Aldrn a travs del tiempo. B. Degradacin del
aldrn por B. licheniformis a travs del tiempo.

CONCLUSIONES

La degradacin de aldrn en el bioensayo fue influenciada por la interaccin

entre B. licheniformis y factores abiticos.

La bacteria B. licheniformis aislada de la CGSM, present 24% de degradacin

de la concentracin inicial de aldrn.

Se evidenci 31% de degradacin del plaguicida organoclorado aldrn por

factores abiticos, como consecuencia de procesos fotoqumicos y prdida
por volatilizacin.

Evaluacin de la degradacin
del plaguicida clorpirifos en
muestras de suelo utilizando
el hongo Phanerochaete
chrysosporium

PLAGUICIDA CLORPIRIFO
Es uninsecticidaorganofosforadocristalino que inhibe
laacetilcolinesterasa causando envenenamiento por colapso
del sistema nervioso del insecto. Se le conoce por muchos
nombres comerciales. El clorpirifo es moderadamente txico y
la exposicin crnica se ha relacionado con efectos
neurolgicos,
trastornos
del
desarrollo
y
trastornosautoinmunes.

PHANEROCHAETE CHRYSOSPORIUM
Uno de los microorganismos ms estudiados en la biorremediacin, es el
hongo Phanerochaete chrysosporium, el cual es un basidiomiceto tambin
denominado el hongo de la pudricin blanca, que por su capacidad
ligninoltica ha sido probado para la degradacin de gran variedad de
compuestos como hidrocarburos, compuestos aromticos clorados,
compuestos fenlicos, insecticidas y fungicidas, entre otros, encontrando
excelentes resultados y logrando en muchos casos la mineralizacin de los
compuestos. Con esta investigacin se pretende desarrollar la primera fase
de un proyecto de biorremediacin, la cual est orientada a la evaluacin
de la inhibicin del crecimiento del hongo a diferentes concentraciones
del plaguicida clorpirifos y a la medicin en el laboratorio de porcentajes
de degradacin del plaguicida que permitan, posteriormente, disear
estrategias de biorremediacin de suelos para zonas agrcolas.

INTRODUCCION
Nuestro grupo de investigacin de la Universidad de Antioquia,
pensando en el problema del deterioro del suelo, ha seleccionado la
tcnica de biorremediacin, como una alternativa de bajo costo y
amigable con el ambiente que puede solucionar o mitigar los impactos
ambientales ocasionados por la contaminacin con plaguicidas. La
biorremediacin es una propuesta de depuracin de suelos, aguas y
aire, basada en el uso de organismos como plantas, hongos y bacterias,
que logra degradar los contaminantes hasta las formas qumicas de
dixido de carbono y agua, y disminuir los efectos causados al
ambiente por la contaminacin.

METODOLOGIA
Diseo experimental

Anlisis de la varianza (ANOVA)

Para evaluar la degradacin del plaguicida efectuada por el hongo Phanerochaete

chrysosporium, se hicieron tres ensayos mensuales (y1, y2 y y3) siguiendo las
directrices de un diseo anidado conformado por dos niveles:
Nivel 1. Das de muestreo (t0, t1, t2 y t3) en cada uno de los ensayos de
degradacin. Cabe anotar que estos tiempos de muestreo corresponden a los das
0, 7, 14 y 21 de cada ensayo.
Nivel 2: Tratamientos (controles y muestras).

Anlisis multivariante de la varianza (MANOVA)

El segundo paso en la propuesta estadstica de esta investigacin fue la

realizacin de un anlisis multivariante de la varianza (MANOVA) con el
objeto de contrastar la signicacin estadstica de las diferencias entre las
medias de los tres ensayos y1, y2 y y3.
Para determinar si el modelo estimado fue adecuado para describir los datos,
es decir establecer si las hiptesis e intervalos de conanza utilizados fueron
conables para la inferencia, se efectuaron grcos de residuales y pruebas
de normalidad, multinormalidad y varianza constante, linealidad,
diagnsticos de datos inuenciales y de multicolinealidad.

Evaluacin de la inhibicin del crecimiento del hongo:

Antes de iniciar los procesos de degradacin del plaguicida en el suelo,

se hicieron ensayos de inhibicin del crecimiento del hongo en cajas de
petri con medio Sabureau a doce concentraciones de clorpirifos.
En total se prepararon 13 muestras (una de ellas represent el control)
con dos repeticiones cada una, las cuales contenan 22 mL de agar
Sabureau, 10 mL de agua destilada y autoclavada con concentraciones
de 480, 400, 200, 100, 50, 9, 6, 3, 0,9, 0,6, 0,3 y 0,1 mg/L de clorpirifos
y una pequea porcin del hongo cultivado de forma supercial sobre
cada caja. Dichas muestras se dejaron incubando 8 das a una
temperatura de 37 C para posteriormente evaluar visualmente el
crecimiento del hongo a las diferentes concentraciones de clorpirifos.

Evaluacin de la degradacin del clorpirifos

Las muestras de suelo involucradas en el proceso de degradacin

fueron recogidas del campo y llevadas al laboratorio; seguidamente se
seca-ron al aire durante dos das, y se pasaron por un tamiz de malla 2
mm antes de colocarlas en una estufa a 100C durante 24 horas para
eliminar el contenido de humedad.
El suelo utilizado en los ensayos present textura arcillo-arenosa, con
conductividad elctrica de 0,516 dS/m, capacidad de intercambio
catinico de 13,74 meq/100 g de suelo, porcentaje de materia orgnica
de 7,83 y pH de 6,1.

Extraccin del clorpirifos

Para extraer el clorpirifos de las muestras se agreg a las muestras con

hongo y a los controles, 35 mL de una mezcla formada por hexano
(grado cromatogrco) acetona (grado cromatogrco) en una relacin
1:1, se taparon hermticamente y agitaron a temperatura ambiente
durante 12 horas a 240 rpm. Luego por decantacin en probeta se separ la fase orgnica, se midi su volumen y se tomaron 250 L de fase
orgnica y se cuantic su clorpirifos por cromatografa de gases.

Cuanticacin del clorpirifos presente en las muestras

Para calcular la cantidad de clorpirifos presente en la fase orgnica,

luego de cada tratamiento, se tom un volumen determinado de la fase
orgnica y se diluy en una mezcla de acetato de etilo-hexano 1:1 y se
inyect un microlitro al cromatgrafo de gases.

Resultados y anlisis de resultados

Inhibicin del crecimiento:

Para evaluar la inhibicin del crecimiento del hongo a diferentes concentraciones de clorpirifos, las
muestras fueron incubadas por ocho das, como se indic en la parte metodolgica de esta
investigacin; encontrando que P. Chrysosporium crece en agar Sabureau y agua en concentraciones
de clorpirifos que variaron entre 0,1 y 480 mg/L. Esta evaluacin se efectu de forma visual,
notando que el hongo no present cambio de coloracin a altas concertaciones.

Evaluacin de la extraccin del plaguicida en el suelo:

En los ensayos de degradacin del clorpirifos, se encontr en la semana cero de los tres ensayos
(vanse guras 1, 2 y 3) el 73,42% de extraccin en promedio para los controles y para las muestras
con hongo el 82,38%. Estos valores segn lo reportado en la literatura son ptimos entendiendo que
los procesos de extraccin por agitacin mecnica de plaguicidas en suelos son bastante complejos,
pues involucran agentes como la textura del suelo, la solucin compuesta por acetona, hexano,
agua y minerales que se forman durante la agitacin, el contenido de materia orgnica de las
muestras, la temperatura del ambiente de agitacin y la evaporacin de los solventes, entre otros.

Anlisis conjunto de los tres ensayos:

En este proyecto se obtuvieron, porcentajes de degradacin en promedio de 96,31%

para las muestras con hongo del ensayo uno, de 82,38% para el ensayo dos y de 69,17%
para el tres. Esto indica que a medida que disminuye la concentracin en los ensayos,
aumenta el porcentaje de degradacin del plaguicida aproximadamente en un 13%.
Esto fue evaluado mediante MANOVA, encontrando que no existe diferencia estadstica
entre las medias de las muestras obtenidas semanalmente, lo cual indica que las
condiciones utilizadas en los ensayos como: concentracin de plaguicida, cantidad de
hongo adicionado, contenido de nutrientes, temperatura, tipo de suelo y el soporte
aplicado, favorecieron el efecto del hongo sobre la degradacin del plaguicida.
Por otro lado, los valores de degradacin alcanzados en los ensayos 2 y 3 indican que es
necesario generar investigaciones adicionales que permitan evaluar cmo el cambio en
las condiciones de crecimiento del hongo, adicin de oxgeno a las muestras como lo
sugiere Bumpus et al. cambio de soporte, entre otras, acelera el proceso de
degradacin.
Esto indica que es importante en estudios posteriores, evaluar cmo la mezcla del
hongo con otros microorganismos, puede generar sinergismos que aumenten la
velocidad de degradacin del clorpirifos y reduzcan el tiempo y los costos de los
proyectos de biorremediacin.

Conclusiones

El hongo P. chrysosporium puede crecer en agar Sabureau y agua, en concentraciones de

clorpirifos que varan entre 0,1 y 480 mg/L.

En los resultados del anlisis univariado, se encontr que existe diferencia significativa entre los
datos obtenidos en los controles y las reacciones, lo cual evidencia el efecto que causa la adicin
del hongo, sobre la disminucin en la concentracin de clorpirifos presente en las muestras.

En los datos del anlisis multivariado se prob estadsticamente, que existe diferencia
significativa entre las medias de los porcentajes de extraccin de los tratamientos en los tres
ensayos, lo cual muestra que el cambio en la concentracin inicial de clorpirifos en cada ensayo
afecta la diferencia en el porcentaje de extraccin entre los controles y las reacciones,
encontrando mayor degradacin del plaguicida en el ensayo 1.

Durante los 21 das de investigacin se lograron altos porcentajes de degradacin para los tres
ensayos, teniendo en promedio, valores de 96,31% para el ensayo uno, de 82,38% para el dos y
69,17% para el tres.

Existi una tendencia ascendente en las curvas de degradacin de las muestras con hongo,
acercndose claramente al 100% de degradacin, lo cual muestra que las condiciones utilizadas en
la investigacin, fueron favorables para la degradacin del plaguicida por parte del hongo.

Recomendaciones

Se sugiere desarrollar una segunda fase de investigacin orientada a

evaluar si el hongo Phanerochete chrysosporium es capaz de
desarrollar procesos de cometabolismo y sinergismos con los
organismos presentes en el suelo y estudiar cules son los mecanismos
que utiliza el hongo para la degradacin, lo que involucra la accin de
las enzimas intracelulares y extracelulares.

Igualmente, se deben evaluar los productos intermedios de

degradacin del clorpirifos, con el objeto de ver si estos compuestos
son ms mviles y ms txicos que el clorpirifos y cmo su produccin
afecta el equilibrio de los ecosistemas del suelo.