LOCALIZACIóN DE LA

PERMEASA GENERAL DE
AMINOáCIDOS EN
NEUROSPORA CRASSA
Jovani Catalán Dibene
25 de agosto de 2009
Contenido
 Introducción
 Antecedentes
 Hipótesis
 Objetivos
 Metodología
 Resultados
 Conclusiones
 Perspectivas

Introducción
Los hongos y su importancia.

El Reino Fungi
 Eucariontes
 Heterótrofos
 Unicelulares o multicelulares
 Reproducción sexual y asexual
 Formadores de esporas
 Pared celular


Dr. David Midgley

Matthieu Legendre
Importancia ecológica y
social
 Importancia biológica
 Importancia agrícola y socioeconómica

A LB E R T O N , O ., & K U Y PE R ,
T.
Hongos filamentosos
 Ostiolo
Neurospora
Pared Asca con
crassa peritecial ascosporas
Mitosis,
Ascospora formación
germinando de
Hifa
vegetativa ascosporas
Microcoloniade la Meiosis
ascospora
Periteci II
o

Ciclo asexual Meiosis

(Macroconidiación ) I Fusión
núclear

División
Ciclo conjugada
sexual
Crozie
Conidia de tipo de Pared r
apareamiento distinto peritecia
l

Tricogina Croziers
Célula ascogonial
Núcleo ascogonial Hifa ascogena
Núcleo
fertilizante

Protoperiteci Deacon, 2000.

Antecedentes
Transporte de solutos y las permeasas

 Transporte de solutos
 Canales y
Permeasas
 Dos sistemas: alta
afinidad y baja
afinidad
 Cationes, azúcares
y aminoácidos

Mariana Ruiz Villarreal

Forsberg y Ljundahl,
Aminoácidos
 Proteínas
 Capaces de
biosintetizar los 20
aminoácidos
 Nutriente más
transportado
 Prefieren obtener que
fabricar
 Utilizados como
fuente de carbono o
de nitrógeno.
 Se requiere el NDP o
NCR
 Coordinación entre
anabolismo y
Deacon, 2000.
catabolismo
Transporte de aminoácidos
S. N. crassa
cerevisiae
 Dos tipos
 Número de
permeasas
variable de
especie a
especie
 S. cerevisiae 15
permeasas; N.
crassa 5
sistemas.
 Sistema usado
para obtener
Horak, 1980
nitrógeno
 La permeasa general de
aminoácidos

Rubio-Texeiro y Kaiser
En N. crassa

Margolis-Clark y colaboradores, 2001

Hipótesis
 El homólogo de la permeasa general de
aminoácidos de S. cerevisiae GAP1, se
localiza en vacuolas o membrana
plasmática de las hifas de Neurospora
crassa dependiendo de la fuente de
nitrógeno.

Objetivos
Objetivo general


 Marcar con GFP y localizar GAP-1 en la cepa 9717 de N.

crassa.


Objetivos particulares


 Análisis in silico de ortólogos de GAP1 en N. crassa.

 Obtener un vector que contenga el gen gap-1

fusionado en fase con el gen de la GFP.

 Obtener transformantes que contengan la
construcción pMF272-GAP-1 integrada
correctamente.
 Analizar la localización de GAP-1::GFP mediante

microscopía confocal de escaneo con laser en

presencia de diferentes fuentes de nitrógeno.

Metodología
Cepas utilizadas en este
estudio
Cepa Especie FGSC # Genotipo

SMRP24 N. crassa 9717 Δmus-51::bar+; his-3

SMRP25 N. crassa 9718 Δmus-51::bar+
tJCD-1 N. crassa N/A his+::pccg-1-ngap-1l::sgfp
DH5α E. coli N/A φ80 lacZ ΔM15
 Estrategia

 Identificación del gen

 Secuenciación del

plásmido

 Diseño de oligos

 Transformación N.
crassa
 Amplificación 


 Crecimiento en
 Construcción del distintas fuentes de
plásmido nitrógeno




 Microscopía confocal
BLAST

Gen Puntaje (Bits) Valor E Tamaño de

NCU10262.3 489.574 0 alineamiento
543
NCU05830.3 462.225 0 534
NCU03509.3 445.662 0 518
NCU05168.3 359.762 0 526
NCU07129.3 308.961 0 499
NCU04435.3 280.411 0 532
NCU00721.3 274.633 0 499
NCU10276.3 262.307 0 497
NCU05198.3 243.432 0 490
NCU04468.3 192.2 0 364
NCU02195.3 40.817 9.88423x10-4 260

Basic Local Aligment Seach

Amplificaciones
Nombre Secuencia 5'-3' Tm (°C) Tamaño del fragmento (Kb) Referencia

Gap1-F GCT CTA GAA TGG CCG CTT ACG GC 62.2 2.1 Este estudio

Gap1-R CTT AAT TAA ACA AAA AAA CCG ATA AAC C 52.6 Este estudio

pMF272F CAA ATC AAC ACA ACA CTC AAA CCA 54.5 Dependiente del inserto Freitag et al, 2002

pMF272-R-2 AGA TGA ACT TCA GGG TCA GCT TG 62 Riquelme Pérez et al 2007

MRp10 AGA GAC AAG AAA ATT ACC CCC TTC TT 62 3.2 Riquelme Pérez et al 2007

MRp11 AAC TAC AAC AGC CAC AAC GTC TAT ATC 62 Riquelme Pérez et al 2007

MRp12 ATA ATG AAC GGA AGG TAG TTG TAG AAA G 61 2.1 Riquelme Pérez et al 2007

MRp13 ATG GAT ATA ATG TGG CTG TTG AAA G 61 Riquelme Pérez et al 2007
Amplificaciones
Condiciones
Ciclos Descripción Temperatura (°C) Tiempo
1 Desnaturalización 94 2 min
30 Desnaturalización 94 30 s
Alineamiento Dependiente de oligos 30 s
Extensión 68° Dependiente del tamaño
1 Extensión final 68° 5 min

T^
C
Genoma
T
A
G
A
5’ 3’
. . . T A T^C
C G TT AA NCU10262.3 T
A T
C G
A T
A A
T^T
A T C C
G T C G AG A. . . ^T
A A A A T
T T

5’ 3’
Xba I Pac I
Construcción del plásmido

G A
C T A
NCU10262.3 TA TT A
Obtención de
transformantes
Secuenciación y transformación
en N. crassa
Electroporació
Lisis alcalina Secuenciación n

1 µg/µl de
plásmido
en 40 µl de
conidias

Condiciones de
electroporación
1.5 kV
25 µF
600 Ω
11-14 ms
Crecimiento en distintas
fuentes de N
Reactivo
Na3C6H5O7x
KH2PO4
NH4
MgSO4
CaCl2
Solución
NO3
x 2H2O
xde
Anhidro
7H2O
Anhidro
elementos
biotina
5.5 H2O
(0.1mg/ml)
traza * Cloruro
Nombrede
Citrato
Fosfato
Nitrato
Sulfato de
desodio
calcio
magnesio
amonio
potasioanhidro 250
Gramos
15
25
110
0.5
500 uL
357.1515
246.48
147.014 g/mol
g/mol
g/mol monobásico
anhidro

Nitrato de
potasio

Urea MMV
 Microscopía confocal
La proteína sGFP tiene su excitación máxima a 488
λ emisión máxima 510 λ.

Microscopio confocal LSM

510 Meta de Carl Zeiss®
Laser de argón 505-530 λ
Regiones de la hifa
Esquema de la regionalización de la hifa según
McDaniel y Roberson (2000).

R3 R2 R1
Resultados
Análisis in silico
Amplificaciones
MPM (-) ngap-1l

3,350 pb

2,027 pb 2,080 pb
1,904 pb
Clonación de la construcción
PCR en Minipreparació
colonias n pJCD - 1
MPM C1 C2 C3 C4
C5 C6 C7 MPM

2,027 pb

8,479 pb

MPM C8 C9 C10 C11 2,027 pb

C12 C13 C14 2,075 pb

2,027 pb
 Selección de transformantes
Microscopio confocal LSM
510 Meta de Carl Zeiss®

Laser de argón 505-530 λ

 Localización de la proteína nGAP-1l
(tJCD-1)
Fuente de N
MMV KNO3 Urea
Localización NH4NO3

Membrana - - -
Vacuolas +++ + +
globulares

Vacuolas tubulares + ++ +++

 a b c
NH 4 NO 3 ( MMV )

a b c
NH 4 NO 3 ( MMV )

d e f
 Localización de la proteína
nGAP-1l
Fuente de N
MMV KNO3 Urea
Localización NH4NO3

Membrana - - -
Vacuolas +++ + +
globulares

Vacuolas tubulares + ++ +++

KNO 3

a b c
KNO 3

d e f
 Localización de la proteína
nGAP-1l
Fuente de N
MMV KNO3 Urea
Localización NH4NO3

Membrana - - -
Vacuolas +++ + +
globulares

Vacuolas tubulares + ++ +++

Urea
Urea

a b c
Comprobación de la integración
2 . 37
Kb
HindI Nde Mut HindI
II I II Nde SmaI
His - 3 - I
3 ’ His - 3 región flanqueante
3 Kb

5 ’ DHis - 3
gfp + gen + 3 ’ His - 3 región flanqueante
pccg1

HindI Nde HindI gfp + gen + 3 ’ His - 3 región flanqueante

II I II pccg1
His - 3 +

pMR10 pMR11 pMR13 pMR12

3 , 2 Kb 2 , 1 Kb
 MPM

pMR10-11 3,350 pb
pMR12-13 3.2 kb
2.1 kb
2,027 bp
Morfología y crecimiento

# 9718 tJCD-1

24 H
Morfología y crecimiento
Conclusiones

 La proteína NCU10262.63 llamada ngap-1l no es el ortólogo
del sistema general de aminoácidos de levaduras, a pesar
de ser la más parecida en estructura a Gap1p.
 La proteína ngap-1l es expresada dependiendo de la fuente
de nitrógeno en el medio. La expresión es localizada en
vacuolas tubulares cercanas a la punta.
 Los estudios realizados indican que es probable que se trate
de una permeasa relacionada con el metabolismo del
nitrógeno. Para determinar si se trata de una permeasa
que se expresa en vacuola, es necesario realizar otro tipo
de estudios.
 En el caso de la permeasa general de aminoácidos en
organismos de diferentes clases taxonómicas, la similitud
en secuencia no es indicador de homología en función, a
pesar de ser genes conservados.
 El estudio de la localización de la permeasa general de
aminoácidos podría ayudar en el entendimiento de la ruta
de secreción en N. crassa, gracias a su regulación
Perspectivas
 Conseguir cepas homocariontes de la
cepa tJCD-1
 Fusionar la cepa tJCD-1 con la VMA-1
 Estudios bioquímicos
 Marcar al menos otros 2 genes arrojados
con el BLAST, en especial el gen naap-1.
Gracias