Replicacin del DNA

Replicacion del DNA

Es un proceso complejo, mediante el cual a partir de una molecula de
DNA progenitora o parental se sintetiza una nueva, originandose dos
moleculas de DNA hijas, de secuencia identica a la del DNA original

La replicacion de los cromosomas

eucarioticos ocurre una vez por ciclo celular
Relacin :
Estado Replicacin Progresin del ciclo

Inicia Replicacin DNA

Clula inicia divisin celular

Cuando inicia debe No hay divisin celular hasta

terminar
que se complete la replicacin

El final de la replicacin Posible seal Divisin

La replicacion se produce de forma

coordinada con la la division celular, en
fase S, previas a la mitosis y Meiosis I.
Caracteristicas principales del proceso:
Caracter semiconservador
Realizacion simultanea (en ambas hebras)
De forma secuencial
Con caracter bidireccional
Origen monofocal (procariotas) o multifocal
(eucariotas)

Replicacin o Sntesis del ADN

Es el mecanismo por el cual se copia la informacin

codificada en una molcula de ADN
AT
AT
TA
GC
TA
CG
AT
CG
Mol original

A
A
T
G
T
C
A
C

T
T
A
C
A
G
T
G

Separacin

AT
AT
TA
GC
TA
CG
AT
CG

AT
AT
TA
GC
TA
CG
AT
CG

Mol. Nuevas (vieja-nueva)

Replicacin del DNA

Mecanismos de Replicacin:

Replicacin del DNA

Experimento de Meselson y Stahl

Replicacin del DNA

Experimento de Meselson y Stahl

CARACTERSTICAS REPLICACIN:
b) Sntesis simultnea
en ambas hebras

c) Secuencial

d) Bidireccional

Sntesis no comienza al azar:

Orgenes de replicacin

c/u apertura local de la doble hlice

Comienza sntesis simultnea de 2 nuevas hebras

Simultneo contnuo

2 hebras nuevas se van alargando progresivamente

Adicin secuencial de Nucletidos

Separacin 2 hebras progenitoras (comienza en cada origen)

Progresa en ambas direcciones

Adicin 53

OH

PP
OH

PP

P
P

OH

OH

P P + H2O

OH

OH

.Enzimas que actan

1.

2.
3.

4.

Desenrollar la doble
hlice y Liberar la
tensin de torsin
Separar las dos hebras
Mantener la hebras
desenrolladas
Sintetizar las nuevas
cadenas

1.

Topoisomerasas

2. Helicasas
3. RPA-Replication
Protein A
4. Primasas y
Polimerasas

Topoisomerasas:

enzimas que se unen

al ADN y rompe enlaces fosfodiester en
una hebra o dos hebras del ADN
La misma enzima une los extremos rotos de ADN (ligacin)

Tipo I nick o muesca en una

cadena

Tipo II ruptura de doble banda

Macrofotografa electrnica del ADN viral de SV40

Polimerasas:

enzimas que pueden formar

una cadena de ADN a partir de una hebra
molde

De acuerdo al anlisis de secuencias las

DNA polimerasas se clasifican en 7
Familias (Hogg et al 2005) :

A, B, C, D, X, Y, RT
Tres subdominios:

Fingers: interacta con la hebra molde

Palm: Sitio de catlisis y de unin con metales
Thumb: contacto con dsADN

Tipos de DNA polimersas

Todas las polimerasas tienen actividad

de extensin o elongacin del ADN

Se aade un nucletido a
la vez en la parte 3-0H
de la cadena

El sentido de la nueva
cadena es 5-3
Alta fidelidad: ~ 10-8/ 10-10
Tipo de polimerasa y
secuencia

Todas las DNA Polimerasas requieren de un cebador

para iniciar la sntesis de ADN

Primasa: Sintetiza fragmentos cortos de 40-400 nt de RNA

Tipos de Cebadores
RNA
retrovirus

ADN

parvovirus

Protena-nucletidos

Adenovirus

La DNA polimerasa tambin

tiene correccin de prueba

La DNA polimerasas se
encuentran en todos los
organismos

E. Coli tiene tres DNA

polimerasas
Characteristic

Polymerase I

Polymerase II

Polymerase III

gene

polA

polB

polC

MW

103,000

90,000

130,000

400

100

10

yes

yes

yes

3-5 exonuclease

yes

yes

yes*

5-3 exonuclease

yes

no

no

Number/cell
5-3 elogation

biological
DNA repair, RNA SOS DNA repair
replicative chain
function
primer excision
(?)
growth
*3' exonuclease function carried out by the DnaQ protein,
a subunit of the core enzyme

Eucariotes tiene cinco DNA

polimerasas
Enzimatic
Activity

Location

Size of
Catalytic
Subunit

Alpha (I)

nucleus

160-185
kD

NO

lagging strand
replication

beta

nucleus

40 kD

No

DNA repair

mitochondrion 125 kD

Yes

mitochondrial
DNA replication

nucleus

Yes

leading strand
replication

Polymerase

gamma
Delta (III)

125 kD

3-5
exonuclease

210-230 or
epsilon
(II)
nucleus
Yes
Todas tienen actividad 5-3125-140
de elongacin
kD

Biological
Function

replication (?)

Otras Enzimas
Helicasas
Separan las
hebras de
ADN

Proteina SSB

DNA helicasa desenrolla la doble

hlice:
DNA Helicasa: Protenas hexamricas en
forma de anillo, que catalizan la separacin
de las dos cadenas de DNA.
Se mueve a lo largo del DNA en una
direccin fija (POLARIDAD). Requiere la
energa suministrada por la hidrlisis del ATP.

Protenas SSBs
Protenas SSBs

- Estabilizan las cadenas separadas.

- Interacciones electrostticas con la columna de fosfato.
- Interacciones de apilamiento con las bases del DNA.
- Presentan unin cooperativa.

 Ligasas
Unen dos
fragmentos
de ADN

Ligasas

Enzimas de replicacion

Proteina SSB =
single strand binding
protein

DNA girasa

Primasa

El replisoma: una maquinaria de replicacin extraordinaria

Modelo del replicn del inicio de la replicacin

1963 Franois Jacobs, Sydney Brenner y Jacques Cuzin

Modelo que explica proceso de replicacin en bacterias:
Origen de replicacin Replicn
Uno en procariotes (monofocal):
Comienza siempre en un punto determinado ORIGEN
Progresa formando 2 horquillas de replicacin
Mltiples en Eucariotes (multifocal):
C/crs existen mltiples orgenes de replicacin (centenares miles)
Progresan dando lugar a un nmero doble de horquillas

Componentes que controlan la iniciacin de la replicacin

Replicador grupo de secuencias suficientes para dirigir la iniciacin
de la replicacin del DNA Origen de replicacin
Protena Iniciadora Reconoce especficamente una secuencia de
DNA (iniciador) activa la iniciacin de la replicacin

Secuencias Replicador

Las secuencias replicadoras, presentan dos

caractersticas comunes
Sitios de unin Maquinaria de replicacin
Regiones ricas en AT Fcil desenrollamiento

OriC (E. coli)

13

13

13

245 pb

SV40
EP

EP

65 pb

Mltiplesorigenesdereplicacinen
eucariotes

Unin y desenrrollamiento: seleccin del

origen y activacin por la protena iniciadora

Protena Iniciadora:
Unin a sitio especifico don el Iniciador
Desenrrollamiento del sitio adyacente al sitio de unin.
Interaccin con otras protenas Reclutamiento

Eucariotes Iniciador Complejo proteico

Complejo de reconocimiento del origen (ORC)

Funcin de la protena iniciadora durante la

iniciacin de la replicacin del DNA

Iniciacion del proceso de

replicacin

Iniciador unido a Replicador Inicio de la

replicacion Interacciones proteina-proteina y
proteina-DNA Esamble de dos orquillas de
replicacion (Burbuja de replicacion)

REQUERIMIENTOS DE LA REACCIN DE SNTESIS:

Cebador: Fragmento de ADN
Sustratos: dNTPS
Cofactores: Mg2+
Molde o plantilla
Mecanismo de la reaccin
Direccin de la sntesis
Enzimas

FASES:
Iniciacin: topoisomerasa, helicasa, protenas unidas
a hebra sencilla, primasa y cebador
Elongacin: DNA polimerasa, horquilla de replicacin
Terminacin, maduracin y unin de los fragmentos
de Okazaki

FASE DE INICIACIN
A partir de los puntos de iniciacin se originan las denominadas burbujas de
replicacin, las cuales presentan dos zonas con forma de Y llamadas
horquillas de replicacin que se van abriendo gradualmente a medida que se
sintetiza nuevas hebras complementarias de ADN
Burbujas de
replicacin

5
3

Horquillas de
replicacin

HORQUILLA DE REPLICACIN
CADENA ADELANTADA

3`

5`
CADENA RESAGADA

Fragmentos de Okazaki

- CADENA CONTINUA:
continua.

Se sintetiza de forma

- CADENA RESAGADA: Se sintetiza por medio de

fragmentos de OKAZAKI

Abrazaderas deslizantes
Aumentan la procesividad de la DNA polimerasa.
Compuesta por mltiples subunidades idnticas que se
ensamblan en forma de dona, y contiene molculas de
agua entre el DNA y la protena.

Primers de RNA:
Para iniciar la replicacin se requieren
primers de RNA, que son sintetizados
por una RNA polimerasa PRIMASA.
- Cadena continua:
Necesita un solo primer.
- Cadena rezagada:
Necesita varios primers.

Remocin de los primers de RNA

deben ser removidos:
Los primers RNA son removidos por la
RNAasa H, que remueve todo el primer
excepto el ltimo ribonucletido unido
directamente al extremo terminal del DNA.

Protenas enganchadoras
Cataliza la abertura y ubicacin de la
abrazadera deslizante sobre el DNA.
El proceso es acoplado a la unin de ATP y a
la hidrlisis.
Procariotes

Complejo

Eucariotes

Factor de replicacin (RFC).

FASE DE ELONGACIN
Es la fase en la que tiene lugar la sntesis de nuevas hebras de
ADN complementarias a cada una de las dos hebras de ADN
originales.
En esta fase intervienen varios tipos de ADN polimerasas que se
nombran como I, II y III.
La actividad de estos enzimas es por una parte polimerasa, es
decir que seleccionan y unen entre s los nucletidos que
corresponden a los complementarios de la hebra molde a medida
que la van recorriendo.
Actividad exonucleasa, por la cual se eliminan nucletidos
errneos o mal apareados y fragmentos de ARN colocados
provisionalmente.

Sntesis del DNA en la horquilla

de replicacin

En la horquilla de replicacin se sintetizan a la

vez las cadenas adelantada y retrazada.
Procariotes
Complejo
multimrico
=
Holoenzima DNA Pol III

Terminacion

Final de
elongacion

Replicacion de los telomeros

Acortami
-ento de
50 200
pb por
cada
division
celular

Qu son los telmeros?

Estn localizados en los extremos de los

cromosomas
Sin los telmeros, los cromosomas son
inestables y pueden combinarse con otros
cromosomas para formar cr. dicntricos o anillos
Protegen al cromosoma de la degradacin
Permiten la replicacin completa de cada
cromosoma
Posicionan a los cromosomas dentro del ncleo
Sus secuencias tienen estructura y funcin
propias
Tienen unas 6-10 kilobases, y consisten de unas
250 1500 repeticiones de una secuencia rica
en G, en los vertebrados es TTAGGG

Replicacion en procariotes
Mecanismos de replicacin es mas simple:
Hay una sola unidad de replicacin
Genoma bacteriano es un replicn circular
unico de 4200 kb
La velocidad de replicacin es
aproximadamente = 50,000 pb/mn
Tamao de los fragmentos de Okasaki = 1 a
2 kb
Concierna un unico origen de replicacin, a
partir de la cual progresan dos orquillas de
replicacin en direcciones opuestas.

... Replicacion en procariotes

Intervienen las topoisomerasas :
Topoisomerasa I que produce una rotura
transitoria a nivel de una de las dos
hebras de DNA, a una pequea distancia
de la horquilla, lo que permite el
relajamiento de la molecula.
Toposisomerasa II provoca una rotura
transitoria en los dos cadenas de DNA de
una de las dos molculas hijas, liberando
asi las moleculas, de una del otro.

There are two types of plasmid integration into a host bacteria: Nonintegrating plasmids replicate as with the top instance; whereas episomes,
the lower example, integrate into the host chromosome.

Replicacion de genoma
bacteriano

Replicacion de genoma
mitocondrial

Modelo
circulo
rodante

Replicacion en Eucariotes
Origen de replicacin en:
levadura : 500 replicones
Plantas superiores: 35,000 replicones
Mamiferos: 100,000 replicones
Longitud de los replicones: varia entre 40 a
300 kb
Velocidad de replicacin en eucariotes es
ms lento que en procariotes:
Sapo: 500 pb/mn
Drosophila: 2600 pb/mn
Levadura: 3600 pb/mn

VelocidaddesntesisdeDNA(mltiplesorgenes)
Organismo

E. coli

Genoma

4.6 Mbp

Levaduras 14 Mbp (1 cm)

Velocidad de
la horquilla

Fase S

Origenes

Comentario

S mayor al doubling time

30 kb/min

40 min

3 kb/min

20 min

330

S durara 80 horas con 1 ori

1 L de cultivo = 4.1010 clulas 400 000 km de DNA sintetizado (distancia Tierra - Luna)

Humanos 3 Gbp (2 m)

3 kb/min

7h

>10 000 ?

S durara 1 ao con 1 ori

2.1013 km de DNA sintetizado ( 2 aos luz ) durante el tiempo de vida ( 10 16 divisiones celulares )

... Replicacion en Eucariotes

Los fragmentos de okasaki (FO) son ms
chiquitos que en los procariotes, son
aproximadamente de 100 a 200 bases
La replicacin de secuencias de DNA
localizadas en los terminales de los
cromosomas, trae mecanismos particulares.

Otros mecanismos de replicacin

a.DNA de mitocondrias
La replicacin en mitocondrias es diferente a lo
de DNA circular bacteriana.
Al inicio una sola hebra de las dos hebras
parentales, llamado la hebra H es utilizado
como matriz para la sintesis de nuevo hebra.
La hebra que no sirve de matriz, llamada la
hebra L, forma una orquilla, conocido como
orquilla de desplazamiento, orquilla D. La
hebra L es igualmente desplazada.

... Mitocondrias
Hay dos origenes de replicacin en el DNA
mitocondrial de los mamiferos; uno sobre la
hebra H y la otra sobre la hebra L.
Sin embargo ciertos DNA mitocondrial
pueden tener varios orquillas de
desplazamiento, lo que atestigua tantos
nmeros de origen de replicacion.
DNA de cloroplastos
El DNA de cloroplastos de plantas
superiores, se describe el mismo mecanismo
que para las mitocondrias, con la presencia
de dos orquillas de desplazamiento.

REPARACIN DEL ADN

Las mutaciones pueden ser el resultado de:

Una incorporacin incorrecta de bases durante la replicacin
Producto de cambios qumicos espontneos
Exposicin de agentes qumicos y/o radiaciones

Cncer

Dao
DNA

Mutacin
Replicacin errnea
Replicacin

Reparacin
DNA

Dao persistente DNA

Inestabilidad genmica

Envejecimiento
celular

Dao DNA

Dao DNA

DNA
Reparado

Defecto
DNA no reparado

Estabilidad
Gentica

Inestabilidad
Gentica

CA
Enfermedades
hereditarias

Divergencia
Gentica

La fidelidad en la replicacin es crucial para la reproduccin celular.

Se estima que la frecuencia de errores durante la replicacin

corresponde a una base cada 109 a 1010 nucletidos incorporados.
Este frecuencia es mucho ms baja que la predecida en base a la
complementaridad de las bases.
Esto se debe a las propiedades de la DNA polimerasa.

Tipos (nomenclatura) de mutaciones

Mutaciones puntuales: afectan a una sola base
Sustituciones: transiciones Purina por purina o pirimidina por pirimidina
transversiones Purina por pirimidina o viceversa
Inserciones o delecciones de una letra
Inserciones o deleciones de mayor tamao
En secuencias codificantes
silenciosa
No produce cambio de aminocido
missense
Produce un cambio sinnimo
Produce un cambio significativo
Nonsense
Produce un codon de stop
Frameshift

Ocurren mutaciones en condiciones

naturales por:
Errores de las polimerasas (proofreading, slippage)
Reacciones espontneas del DNA (tautomera,
despurinizacin (10000/ciclo), desaminacin de C o 5-meC)
Exposicin a mutgenos naturales, estrs oxidativo
Exposicin a radiacin
Inserciones de trasposones/virus
Traslocacones/recombinacin
Etc.

La mayora se reparan, por suerte.

Tipos de Dao
Deaminacin de Bases
Remocin del grupo amino (citosina-uracilo) (adenina- hipoxantina)
(guanina-xantina)
Problema de mal apareamiento, transmisin de una mutacin
Agentes que causan deaminacin
Calor (37C)
Hidroxilamina (in vitro, citosina)
Bisulfito (citosina simple cadena)
cido Nitroso (aditivos alimenticios; adenina y guanina)

CanbasepairwithCytosine

CanbasepairwithThymine
Mostfrequentdeamination

Agentes Mutagenicos fisicos y quimicos

y suS Mecanismos de accin

UTGENOS QUMICOS
mayora causan modificaciones de bases

stancias reactivas
eres de alquilo, agentes alquilantes) Etilmetanosulfonato
entes desaminantes, cido nitroso

accionan con las bases y producen derivados con apareamiento ano

dicales libres, hidroxilamina

logos de bases
5-Bromouracilo
2-Aminopurina

incorporan al DNA y producen apareamiento anormal

Anlogos de bases
5-Bromouracilo, se incorpora como T
Produce transiciones T > C

Anlogos de bases
2-Aminopurina, se incorpora como A
Produce transiciones A > G

Sistemas de Reparacin del

DNA
Reparacin Pre-replicativa:
Reparacin por Foto reactivacin
Reparacin por Essicion
Reparacin Post replicativa:
Reparacin por actividad de la
desoxinucleotidiltransferasa terminal
Reparacin Por Precombinacin gnica
Respuesta SOS.

Reparacin de dmeros de pirimidinas

mediante fotoreactivacin

Mecanismo
s de
reparacin
de DNA:
BER (Base
excision
Repair)

REPARACION POR
RECOMBINACION