INTRODUCCIN

El tomate verde (Physalis ixocarpa)

Calc
io

Fsforo

o
Hierr

s
Sale ales
r
mine
Vitamina
C

SIAP - SAGARPA 2007-2013

8 estados Repblica Mexicana.
80% concentran la produccin tomate
verde.
Sinaloa, Michoacn, Puebla, Jalisco,
Mxico, Morelos, Sonora y Zacatecas.

Grfica 1. Comportamiento de la Produccin del

Tomate Verde

 El uso de agroqumicos en la produccin

de tomate verde se ve influenciado por
la baja fertilidad del suelo, lo que hace
necesario la aplicacin de nitrgeno
(N), fsforo (P) y potasio (K), para
asegurar el rendimiento adecuado.

Microbiota del suelo

Bacterias, hongos, algas entre otros.
Funciones:
Fijacin de nitrgeno
Mineralizacin
Solubilizacin de fsforo

BACTERIAS PROMOTORAS DEL

CRECIMIENTO VEGETAL

Fijacin biolgica de nitrgeno

atmosfrico

Reducido
Fijado (combinado) en iones amonio (NH4+).

Bacterias diazotroficas

Fijacin de
nitrgeno
atmosfrico

Solubilizaci
n de
minerales

Biocontrol
de
microorga
-nismos
patgeno
s

Sntesis de
fitohormon
as

N2 + 16ATP + 8e- + 8H+ 2NH3 + 8H2 + 16ADP 16Pi

Solubilizacin de Fsforo
El fsforo es el segundo
nutriente
inorgnico ms requerido por las
plantas y microorganismos.
Se
encuentra
en
muy
baja
concentracin
con
valores
comprendidos entre 5 y 30 mg kg-1 .

Produccin de Siderofros
Los siderforos son compuestos que
desempean la funcin de solubilizar
especficamente el hierro e incorporarlo al
metabolismo celular.
El
mecanismo
bioqumico
de
los
siderforos, implica el transporte y la
liberacin del hierro dentro de la clula,
involucra una serie de reacciones de
xido-reduccin.

Antecedentes

ANTECEDENTES
INDIRECTOS
EFECTO DE LA
INOCULACN
CON
Azospirillum
sp. EN
PLANTAS DE
CHILE
HABANERO
(Capsicum
chinense

(Canto-Marn et al.;

Efecto de la inoculacin en plntulas de

chile habanero (Capsicum chinense)

(Canto-Marn et al.;

Efecto en la radiculacin de la
planta

(Canto-Marn et al.;

ANTECEDENTES
DIRECTOS
20 a 30
cm

20
m2

ANLISIS DE SUELO FORESTAL

AISLAMIENTO DE BACTERIAS
DIAZOTRFICAS
B

Figura 3. Resultado del aislamiento de bacterias

diazotrficas de un suelo forestal A. Del gnero
Azospirillum en medio NFB y B. del gnero
Azotobacter en medio Holguin.

JUSTIFICACIN
El tomate verde (Physalis ixocarpa) es un cultivo originario
de Mxico con un alto ndice de demanda agroindustrial.
Sin embargo, la produccin de este cultivo es potenciada
con el uso de fertilizantes nitrogenados, generando
contaminacin debido al uso excesivo de los mismos, as
como deficiencia en la produccin a largo plazo, adems
de un elevado costo de produccin. Por todo lo anterior,
existe la necesidad de encontrar alternativas sustentables
para la produccin de este cultivo agrcola, teniendo el
presente proyecto como finalidad implementar nuevas
biotecnologas para la promocin del crecimiento de ese
cultivo como lo son el uso de bacterias diazotrficas de
suelos forestales con capacidad de promover el
crecimiento vegetal.

HIPTESIS
Las bacterias diazotrficas de suelo
forestal de Ciudad Hidalgo, Michoacn
(coordenadas
19.61,-100.67)
son
capaces de promover el crecimiento
vegetal in vitro de Physalis ixocarpa

OBJETIVOS
Objetivo General
Evaluar el efecto sobre el crecimiento vegetal de Physalis ixocarpa
por bacterias diazotrficas de suelo forestal de Ciudad Hidalgo,
Michoacn.

Objetivos Especficos
Identificar bioqumica y molecularmente las bacterias diazotrficas
asiladas de suelos forestales
Analizar in vitro la promocin del crecimiento vegetal de Physalis
ixocarpa por bacterias diazotrficas forestales.

Estrategia experimental
Reactivacin de las
cepas bacterianas

Identificacin
bacteriana por pruebas
bioqumicas

Inoculacin de plantas

Evidenciar la asociacin
planta-microorganismo

Evaluar paramtros del

crecimiento vegetal.

Idenificacin de las
cepas bacterianas por
amplificacin del gen
ribosomal 16S

Materiales y mtodos
Reactivacin de cepas bacterianas
Resiembra de las
suspensiones bacterianas
sobre medio LB

Resiembra en medio Rojo

Congo y en Agar Almidn

Resultados

Figura . Resultados de la reactivacin de las cepas

bacterianas sobre medio Rojo Congo para Azospirillum
(panel A) y sobre el Agar almidn para Azotobacter
(panel B).

Materiales y mtodos
Identificacin por pruebas bioqumicas
Prueba de motilidad

Preparar una
solucin de
NaCl estril al
0.85%

Colocar una
gota de
solucin sobre
un portaobjetos

Agregar una
colonia y
homogenizar
para observar
al microscopio

Prueba de la catalasa

Preparar una
solucin de
H2O2 al 30%

Colocar una
colonia sobre
un
portaobjetos

Agregar una
gota de
solucin y
observar

Determinacin de compuestos
indlicosIncubar por
Resembrar
Centrifugar

las cepas en
medio Klactato

96 h a 150
rpm en total
oscuridad

Realizar las
graficas de
concentracin
de AIA
correspondiente
s

y extraer el
sobrenadant
e

Colocar una
muestra del
sobrenadante
con el reactivo
correspondiente
al 1:1 (v/v)

Preparar el
reactivo de
Salkowsky

Incubar por
30min a total
oscuridad y leer
a 530 nm

Cuantificacin de nitrgeno fijado

Estandarizar una suspensin bacteriana a
1x108 clulas mL-1 en solucin salina

Se inocular 1 mL de la suspensin en 5 mL de
Medio extracto de suelo al 10%

Se incubar a 30C por 72 h a 150 rmp y

elaborar la curva de concentracin de amonio
Se realizar un procedimiento para
posteriormente detectar la concentracin de
amonio

Se realizar una lectura a 632 nm

Solubilizacin de roca fosfrica

Sembrar las cepas bacterianas en
Agar Sundara Rao Sinha (SRSM)

Incubar a 28 C durante 4 das

El cambio de coloracin a amarillo

en el medio ser un indicativo
positivo de la solubilizacin

Produccin de sideroforos
siderforos se realizar la prueba Chrome Azurol
S (CAS)

Se sembrarn 3 l de cultivo tanto de

Azotobacter como de Azospirillum de 2 y 3 das
de crecimiento respectivamente, en el agar CAS

Se incubarn a 28 C durante 2 semanas

La evaluacin comenzar al observarse el

crecimiento de la bacteria y la presencia de halos
anaranjados alrededor de las colonias

Resultados
Prueba bioqumica

Gnero
Azospirillum

Gnero
Azotobacter

Tincin gram

Motilidad

Catalasa

Produccin de
sideroforos

Solubilizacin de
fsforo

Materiales y mtodos
Inoculacin de plantas de Physalis
ixocarpa
Sembrar 4 semillas de Physalis
ixocarpa sobre placas con medio
MS (Murashige y Skoog, 1962)

Inocular las plantas 4 das despus

de la germinacin

Incubar a 25 C y un fotoperiodo
de 16 h luz y 8 h oscuridad

Materiales y mtodos
Evidenciar asociacin plantamicroorganismo
Inoculacin por contacto de la
raz de la planta inoculada
sobre medio libre de nitrgeno

Cortes y tincin gram de raz

de las plantas inoculadas

Materiales y mtodos
Evaluar los parmetros de crecimiento
vegetal

Peso fresco y peso seco

Longitud de raz
Longitud de tallo
Nmero de hojas
Nmero de races
Color
Dimetro de tallo

Materiales y mtodos
Identificacin de las cepas bacterianas
por amplificacin del gen ribosomal 16S
Extraccin de ADN
Amplificacin del gen
ribosomal 16S por PCR.
Electroforesis en gel de
agarosa
Secuenciacin y BLAST

Gracias por su
atencin