Diagnstico por Mtodos

Inmunolgicos
Tcnicas inmunolgicas
Tcnicas serolgicas

Principios de Diagnstico
Inmunolgico

Las enfermedades infecciosas pueden ser

diagnosticadas definitivamente solo por tres
formas:

1) Demostrar la presencia en el paciente de un agente

conocido capaz de provocar la enfermedad, por
observacin directa en el material clnico obtenido del
paciente o por cultivo de laboratorio (in vivo o in vitro)
2) Deteccin de un producto especfico del agente
infeccioso (que no pueda formarse sin la presencia del
agente) en el material clnico obtenido del paciente
3) Deteccin en el suero del paciente de una
respuesta inmunolgica especfica dirigida contra el
Agente infecciosos

Caractersticas generales de la
respuesta inmune
Categoras de la respuesta inmune
Respuesta inmune mediada por clulas
o Inmunidad Celular
Respuesta inmune mediada por anticuerpos
o Inmunidad humoral
Para determinar si se ha producido un anticuerpo contra
un agente en particular, se investiga en el suero (o
plasma) del paciente la presencia de anticuerpos
El diagnstico de las enfermedades por la medicin de
los niveles de anticuerpo en suero se
denomina serologa

Caractersticas generales de la
respuesta inmune
Caractersticas de los Anticuerpos
Mecanismo determinado genticamente
Dirigidos contra un antgeno o determinante
antignico (eptope)
Los microorganismos pueden contener
numerosos determinantes antignicos
Habr por lo tanto numerosos
anticuerpos para cada antgeno
Muchos determinante antignicos
requieren ser expuestos

Caractersticas generales de la
respuesta inmune
Caractersticas de los Anticuerpos
Los anticuerpos se unen a la
superficie de los patgenos para:
Facilitar su ingestin
por las clulas
fagocticas
(Anticuerpos
opsonizantes u
opsoninas)

Caractersticas generales de la
respuesta inmune
Contribuir a su destruccin por la accin
ltica del complemento (Anticuerpos
fijadores de complemento)

Caractersticas generales de la
respuesta inmune
Caractersticas de los Anticuerpos
Aunque el ser humano produce varias
clases de anticuerpos los mtodos
serolgicos han sido desarrollados
para medir principalmente dos clases:
Inmunoglobulina M (IgM)
Inmunoglobulina G (IgG)

Solo en un caso se han desarrollado mtodos

para detectar la Inmunoglobulina A (IgA):
Toxoplasmosis

Caractersticas generales de la
respuesta inmune
Caractersticas de
los Anticuerpos
IgG
Se producen mas
tardamente pero
persisten mas tiempo.
Dos imgenes
especulares, formadas
por dos protenas, con
los sitios de fijacin
para el antgeno en el
extremo.
Unin mas espedfica
al antgeno (avidez)

Caractersticas generales de la
respuesta inmune
Caractersticas de
los Anticuerpos
IgM
Es el primer anticuerpo
producido en respuesta a
un antgeno (infeccin
reciente)
Cinco protenas idnticas
unidas por la cadena J
Unin al antgeno menos
avida.
No fija complemento

Caractersticas generales de la
respuesta inmune

Caractersticas generales de la
respuesta inmune
Respuesta humoral relativa frente a
un estmulo antignico

Caractersticas generales de la
respuesta inmune
Interpretacin de las pruebas serolgicas
El dogma central de la serologa es el
concepto de aumento de ttulo
Ttulo de un anticuerpo es la recproca de
la mayor dilucin de suero del paciente en la
cual an se puede detectar el anticuerpo

Pacientes con gran cantidad de anticuerpos

tendrn ttulos altos
Dos muestras de suero: perodo agudo y convalecencia. Se
procesan pareados.
Un aumento de ttulo de dos diluciones al medio (1:8 a 1:32) se
considera diagnstico de infeccin reciente (aumento de cuatro
veces el ttulo)
En la actualidad se cuentan con metodologas que permiten
manejar valores mas continuos, en ocasiones hasta en forma
cuantitativa

Principios de los Mtodos

Serolgicos
Reaccin Antgeno-Anticuerpo
La reaccin entre un antgeno y un
anticuerpo dirigido especficamente
contra l da lugar a un complejo antgeno
anticuerpo

Utilizada ampliamente en los laboratorios

para la deteccin y cuantificacin de gran
cantidad de sustancias en diversos
medios biolgicos.

Reacciones de
Aglutinacin
Cuando el antgeno
libre o unido a un soporte se enfrenta al
anticuerpo, el complejo antgeno-anticuerpo resultante se
observa como una aglutinacin
El proceso tiene dos fases: unin reversible y aglutinacin
por formacin de puentes entre los anticuerpos IgG divalentes o
IgM multivalentes y los antgenos
Los anticuerpos IgM son mas eficaces para aglutinar
(Anticuerpos completos). Los anticuerpos IgG a veces
producen entrecruzamientos (Anticuerpos
incompletos)
Se expresan como aumento
de ttulo
Dan fenmeno de prozona
(aglutinacin aparente por exceso de antgeno o anticuerpo sin

Reacciones de
Aglutinacin

Factores que influyen en las reacciones

de aglutinacin
Carga de las partculas
Tipo de anticuerpo
Concentracin de electrolitos
Viscosidad
Nmero de determinantes antignicos
Se emplean tanto para la deteccin de
antgenos como de anticuerpos.
Se pueden hacer de dos maneras:
directas o indirectas

Reacciones de Aglutinacin
Directa

Para deteccin de antgenos

Soporte particulado con anticuerpos adsorbidos

Distintos tipos de tcnicas segn la

naturaleza fsica de soporte
Aglutinacin al ltex: partculas de ltex fcilmente visibles
Deteccin en LCR de antgenos de Neisseria meningitidis,
Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae,
Streptococcus agalactiae
Hemaglutinacin pasiva: hemates como soporte
Coaglutinacin: bacterias muertas como soporte;
Staphylococcus aureus expresa la Protena A capaz de fijar el
Fc de los anticuerpos.

Reacciones de Aglutinacin
Directa

Para deteccin de
anticuerpos
Se pueden hacer en tubo, portaobjetos,
placa o pocillo de microplaca.
Se enfrentan las partculas microbianas
(generalmente muertas) en suspensin
con el suero del paciente.

Si el suero del paciente posee anticuerpos frente a la bacteria,

se forman agregados visibles en el fondo del tubo o en el porta
o en fondo de la microplaca.
Deteccin de anticuerpos frente a Brucella (Reaccin de
Huddleson) o Salmonella (Reaccin de Widal.

Reacciones de Aglutinacin
Indirecta

Para deteccin de anticuerpos

Se adsorben los antgenos en un elemento partculado

(partculas de ltex, gelatina o bentonita, o clulas como
hemates humanos, ovinos o de pavo.
Se enfrentan estos elementos (antgeno + elemento
particulado) al suero del paciente.
Se observa la presencia de agregados visibles en el fondo del
tubo, porta o pocillo de microplaca.
Deteccin de Treponema pallidum, Echinococcus granulosus.

Pruebas de Antiglobulina
Se puede utilizar el microorganismo entero o adsorbido a un soporte
particulado.
Se enfrentan estos elementos (antgeno + elemento particulado) al
suero del paciente.
Se incuba la muestra con una anticuerpo anti-inmunoglobulina
humana (anti-gamma)
Se observa la presencia de agregados visibles en el fondo del tubo,
porta o pocillo de microplaca.
til para detectar anticuerpos incompletos, en especial en Brucelosis.

Reacciones de Inhibicin
Basadas en la incapacidad de algunos microorganismos para
realizar determinadas actividades biolgicas en presencia de
anticuerpos especficos. Las mas utilizadas son dos:
- Inhibicin de la Hemaglutinacin
Algunos virus (Rubeola, Influeza, Parainfluenza, Parotiditis,
Adenovirus) se unen a receptores de la superficie de los
hemates provocando su aglutinacin.
Esta aglutinacin puede ser inhibida por la presencia de
anticuerpos especficos en el suero del paciente.
- Neutralizacin
Algunos virus (poliovirus) no desarrollan su efecto citoptico
habitual en clulas de cultivo celular cuando hay presentes
anticuerpos especficos.

Pruebas de Fijacin de
Complemento

Se incuba suero del paciente con el antgeno. En presencia de

anticuerpos en el suero se forman complejos antgeno-anticuerpo.
Se aade una cantidad de complemento (todos los elementos).
Si inicialmente se haban formado inmunocomplejos se produce la
activacin del complemento , consumiendo todos los
componentes del sistema. Si no hay inmunocomplejos todo el
sistema permanece.
Se agrega un sistema revelador constituido por hemates unidos a
anticuerpos antihemates (hemolisina).
Si hay complemento libre (ausencia de anticuerpos en la muestra)
se fija a los complejos hemate-hemolisina y los eritrocitos de
lisan.
Se utiliza en laboratorios de referencia para diagnsticos de

Reacciones de
Precipitacin
Formacin de estructuras insolubles por unin ente el antgeno
soluble y el anticuerpo especfico incapaces de permanecer en
solucin.
El precipitado puede ser puesto de manifiesto mediante tcnicas
de nefelometra o inmunoturbidimetra, que pueden a su vez ser
adaptadas a autoanalizadores de qumica clnica o instrumentos
especializados (nefelmetros o inmunoturbidmetros).
Se pueden usar para determinar protenas reactantes de fase
aguda como PCR o demostrar infecciones previas por
Streptococcus pyogenes por AELO (neutralizacin ltica de
estreptolisina O)
Tambin pueden ser observados por tincin
en placas de agarosa.

Inmunodifusin doble
Tcnica de Outcherlony
Se enfrentan concentraciones conocidas de antgeno soluble
con un antisuero problema en un medio gelificado.
Tras un perodo en el que se permite difundir a ambos
elementos puede observarse en el caso de que existan
anticuerpos, bandas de precipitacin que pueden ser
identificadas a simple vista o mediante tincin proteica
Se emplea en la prctica en la deteccin de anticuerpos frente
a diversos hongos productores de neumonitis por
hipersensibilidad.

Inmunodifusin Radial
Tcnica de Mancini
Se disuelve el anticuerpo en el agar y se colocan en pocillos
diluciones del antgeno.
Si se corre simultneamente una curva patrn puede
cuantificarse por regresin la cantidad de antgeno.
Es mas til para para la deteccin de antgenos que de
anticuerpos

Contrainmunoelectroforesis
Puede ser utilizada tanto para detectar antgenos como
anticuerpos
Combina la electroforesis (migracin de antgenos y
anticuerpos en un gel de agarosa por accin de un campo
elctrico) con la precipitacin (formacin de lneas de
precipitado en un gel de agarosa cuando se produce la reaccin
antgeno-anticuerpo).
El antgeno de carga negativa en medio
alcalino migra hacia el anodo, es decir hacia
los pocillos del anticuerpo. Los anticuerpos
en estas mismas condiciones migran al
polo negativo o ctodo.
Se emplea en la identificacin del Arco 5
de Echinococcus granulosus.

Pruebas con Anticuerpos

Fluorescentes

Se utilizan anticuerpos conjugados con sustancias fluorescentes

(fluorocromos como el isotiocianato de fluoresceina o el naranja
de acridina.
Se observa la presencia o ausencia de fluorescencia observando
con un microscopio de fluorescencia.

Dos variantes:
Tcnica directa (para deteccin de antgenos): se fija la
muestra en un portaobjetos con acetona, se agrega el
anticuerpo marcado con el florocromo (inmunofluerescencia
directa IFD). Deteccin de Pneumocystis carinii en esputo
inducido
Tcnica indirecta (para deteccin de anticuerpos): se agrega
primero el suero del paciente sobre antgeno improntado en
portaobjetos; en la segunda fase se incuba con anticuerpo anti

Inmunohistoqumica enzimtica
Se usa el tejido del paciente, al que se le agrega anticuerpos
marcados con enzimas.
Se revela el marcador y se observa la presencia o ausencia de
color.
Usado para detectar antgeno, en ocasiones post mortem, por
ejemplo pacientes infectados con Rabia

Inmunoensayos
Para detectar antgenos Metodologa ELISA
Utilizan anticuerpos de captura pegados a un elemento fijo,
portaobjetos, esfera de poliestireno, pocillo de microplaca, etc.
Se aade la muestra problema con antgeno
Se lava para eliminar otras protenas unidas en la muestra
Se agrega un segundo anticuerpo contra el antgeno, unido a un
marcador enzimtico (una enzima como la fosfatasa alcalina o la
peroxidasa de rbano picante) .
Se agrega el sustrato de la enzima, que dar un color si haba
antgeno unido
Diagnstico de Chlamydia trachomatis en muestras de cuello
uterino

Inmunoensayos
Para detectar anticuerpos Metodologa ELISA
Utilizan antgenos unidos a un elemento slido
(esfera de poliestireno, pocillo de microplaca al
que se le aade suero del paciente.
Si el suero tiene anticuerpos especficos se unen a os antgenos.
La reaccin se revela mediante un segundo anticuerpo
conjugado con:
Enzima
Enzimoinmunoensayo (EIA)
Istopo radioactivo (I125)
Radioinmunoensayo (RIA)
Sustancia fluorescente
Fluoroinmunoanlisis (FIA)
Se lee la seal con un espectrofotmetro (EIA), contador de
centelleo (RIA) o un fluormetro (FIA)

Inmunotransferencias
Inmunobloting o Western Blot
Separacin de antgeno proteico por electroforesis en gel de
poliacrilamida
Transferencia del antgeno separado a una membrana de
nitrocelulosa
Se incuba la membrana con el suero del paciente y se detectan
los anticuerpos mediante una anti-inmunoglobulina humana
conjugada con una enzima.
Se forman bandas coloreadas donde se ha producido la reaccin
antgeno anticuerpo.
Se puede usar tanto para detectar antigenos como anticuerpos.
Se emplea para confirmar resultados positivos de pruebas de