PROYECTO DE GRADUACION:

Previa la obtencin del ttulo de:

INGIENERO ACUICULTOR
Presentado por:
LLIVISACA CONTRERAS SUSANA ALEXANDRA
VARGAS PREZ JEFFREY DAVID

INTRODUCCION
Dado al alto desarrollo de la actividad minera, a causado en el

Ecuador una contaminacin al medio ambiente. La posible ejecucin

de este proyecto podra establecer las tcnicas para remediar
mediante microorganismos que puedan ser utilizados como
maquinaria en procesos de remediacin de dicho dao ambiental en
el sector del ro Gala en la parroquia Tenguel.

 Basados en caractersticas biolgica podemos citar a las del gnero

pseudomona, puesto que presentan gran rango de resistencia a metales

pesados como el mercurio y un grupo pequeo de estas tienen capacidad
metalofijadoras y metaloreductoras.
Esta caracterizacin de bacterias tiene como fin el otorgar a los pobladores

una rpida recuperacin de las aguas del ro a su estado original,

reduciendo los impactos de salud causados por la contaminacin con
metales pesados, sin recurrir a la adicin de especies extranjeras que a
largo plazo podran desplazar a las especies bacterianas residentes de la
zona.

OBJETIVO
Caracterizar mediante la tcnica PCR-DGGE las bacterias del gnero

pseudomonas presentes en las aguas contaminadas con mercurio en el Ro

Gala (aguas abajo en el recinto San Rafael) en la parroquia Tenguel

OBJETIVOS
ESPECIFICOS
Determinar

la presencia de bacterias metalofijadoras

pseudomona en las aguas del ro Gala por medio del DGGE.

del

gnero

Caracterizar cepas aisladas dentro de los gneros pseudomonas mediante

la caracterizacin qumica implementando medios de cultivos selectivos,

pruebas de resistencia y fijacin de mercurio.
Extraer ADN a partir de las cepas de pseudomonas con capacidad

metalofijadora,
mismas.

y con lo cual se proceder a la caracterizacin de las

Por medio de los valores arrojados por los indicadores, determinaremos la

estructura poblacional bacteriana.

JUSTIFICACION

Desde sus inicios, la industria minera ha sido una fuente

importante de ingresos y de trabajo para el pas, gracias al
desarrollo de la misma, debemos el incremento de la tasa de
empleo, por ello debemos buscar las maneras de hacerlo
sustentable y amigable al medio ambiente.
En los alrededores del ro Gala se realizaban actividades

tursticas y de pesca, pero por la contaminacin, ya dej de

serlo, ahora es un lugar donde sus aguas causan
enfermedades a los pobladores, y la pesca no se desarrolla
por la extincin de algunas las especies en dicha zona. (2007
Estudios realizados de Medio Ambiente del Municipio de
Guayaquil), determinaron que las aguas del ro Gala se
encuentran contaminadas con mercurio y arsnico.

 El beneficio del proyecto ser, buscar un microorganismo capaz de

retirar el mercurio o el arsnico disuelto en el agua, y as contribuir

con su recuperacin y adems los mineros tambin obtendrn
beneficio, debido a que podrn usar este proceso para tratamiento
de efluentes y as reducir los costos que la remediacin ambiental
conlleva.

 La tcnica molecular DGGE es rpida y nos proveer de un perfil de

la diversidad gentica de una comunidad bacteriana presente en el

ro. Este mtodo no slo permite la identificacin de las especies y
expondr su dominancia relativa.

Apenas el 0.1 a 10% de la poblacin bacteriana total se conoce

como clulas cultivables en medios convencionales. El uso de

DGGE, nos provee de informacin mucho ms confiable de la
diversidad bacteriana real de una muestra.

ANTECEDENTES

 En la actualidad existen serios problemas de contaminacin ambiental localizados a

nivel de agua, suelo y aire como consecuencia del desarrollo industrial. Las industrias
generan una serie de contaminantes que alteran las condiciones normales de los
sistemas biolgicos, llegando en unos casos a ser problemas irreversibles.

Los tratamientos fsicos y qumicos son ms costosos que las remediacin biolgica o

la bioremediacin, y as se presenta como una tcnica de recuperacin ms barata

comparada con los anteriores. Estas tcnicas utilizan microorganismos presentes en
el propio medio para realizar la tarea de la depuracin de las aguas y suelos
contaminados. Los procesos de bioremediacin emplean clulas vivas, biomasas,
biopolimeros absorbentes y una variedad de hongos, algas y bacterias que son hoy
en da utilizados como bioabsorbentes de metales pesados. (Geoffrey ,M.2001)

El mecanismo de resistencia para metales pesados ha sido estudiado en E.coli en

Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa. De esta ltima se han

realizado estudios realizados en muestras aisladas de lagos, plantas de tratamientos
y efluentes industriales.

La Pseudomona aeruginosa es la bacteria ms utilizada para realizar bioensayos, ya

que detecta concentraciones bajas de metales pesados en agua. Este tipo de

bacteria es utilizada ampliamente, principalmente debido a su presencia mayoritaria
en aguas contaminadas y es un efectivo parmetro para determinar riesgos en la
salud. (Pumarola A., 1987)

 En un estudio realizado, Muskoka en la provincia de Ontario en Canad, se

efecto el anlisis de las muestras representativas de seis lagos que

contenan altas concentraciones de mercurio en sus aguas. Esta
documentacin demuestra que las pseudomonas presentes en estos lagos
presentaban el mayor porcentaje de resistencias al mercurio a diferencia de
otros lagos con menor concentracin del mismo. Indicando que se
encontraban aproximadamente 20 a 30 aislados colectados en las playas
de cinco de los seis lagos .

Los aislados de pseudomonas presentaban casi el mismo porcentaje de

resistencia que los aislado de pseudomonas presentes en los efluentes de

las plantas de tratamiento del alcantarillado. As, se estableci una
correlacin entre los serotipos y los tipos de fagos entre las P. aeroginosa
presente en los cinco lagos y en el alcantarilladlo (Parrish P. 1980.)

En conclusin determinaron que el 65 % de los aislados que presentan

resistencia al mercurio provienen de los sedimentos. Las P. aeruginosa

presentaba una serie de mecanismos diferentes para la resistencia al
mercurio, ella tambin presenta resistencia mltiple no solo para el mercurio
si no que tambin para el arsnico y cadmio (Hendricks A., 1980.)

 Al igual que la P. aeruginosas, existen otras bacterias capaces de

reducir el mercurio y este grupo de bacterias son utilizadas en los

laboratorios para tratamiento de aguas contaminadas. Las bacterias
Pseudomonas putidas son bacterias que se presentan en los
sedimentos y el los suelos en mayor porcentaje que las P. aeruginosa,
estas bacterias tambin presentan accin metaloreductoras de
mercurio y est ampliamente utilizadas en tratamientos de suelos
contaminados (H. Von Canstein, 1999)

En fabricas productoras de Cloralcali (una sustancia qumica que

contiene cloro y que se usa en el procesamiento qumico) en procesos

de elaboracin de amalgamas presenta un mayor uso de mercurio. En
muestras de lagos aledaos a la zona de descarga se pudieron aislar
las bacterias de tipo Pseudomonas putida en zonas donde la
concentracin de mercurio era de 50 ug de mercurio por litro. Los
aislados fueron identificados por la unidad 16s ribosomal del a
secuencia de DNA. En el experimento la mxima concentracin de
HgCl trasformada por la P. putida fue de 70mg/ por litro en medio
slido y 10 mg/litros en medio lquido (H. Von Canstein, 1999)

 El mercurio es un compuesto qumico ampliamente distribuidos

alrededor de la tierra. Mucha formas de mercurio son toxicas para

los seres vivos. Pero existen organismos capaces de resistir la
toxicidad del mercurio y degradar algunas formas qumicas de este
metal y contribuyen en los procesos normales del ciclo global del
mercurio en el medio ambiente.
La resistencia al mercurio de este tipo de bacterias se encuentra

relacionada por los genes del mer operon localizados en los

plsmidos de las bacterias. Dado este estudio e ha demostrado que
se encuentra presente tanto en bacterias gram positivas como en
gran negativas (Osborn A.M., 1997 )

 En un estudio realizados sobre la Resistencia a metales pesados.

Se determin que las bacterias y hongos son los que presentan una
mayor tolerancia hacia niveles altos de metales. Las muestras
obtenidas fueron colocadas en medios de crecimiento multi-metal
que contenan Ag, As, Bi, Cd, Cr, Co, Cu, Hg, Li, Mo, Pb, Sn, y Zn a
diferente concentracin de estos metales en disoluciones. Las
muestras fueron analizadas por espectrofotometra. Despus de
dejar incubar las muestras se obtuvo un total de 72 aislados de las
muestras que contena una concentracin de metales de 10 -7, luego
esta muestras fueron reincubadas en concentraciones de 10 -6 con
58 aislados, a 10-5 con 50 aislados, a 10-4 con 31 aislados y 16
aislados a 10-3. Lo que indica que los microorganismos presenta una
resistencia a los metales y su efectividad en procesos de
remediacin va a depender de la concentracin de los metales
contaminan y a condiciones fsicas del medio. Dado que las
bacterias que presentes en los aislados con la concentracin 10 -3
son las ms aptas para implementarlas en procesos de
bioremediacin. (Valentina V., 2005.)

LAMPREA EDWIN RIVERA, TORRES LUIS ALEJANDRO, ORTIZ LIZ LOZANO,

Diseo de un biofiltro a escala de banco para la biodetoxificacion de
mercurio (Hg) mediante la utilizacin de microorganismos
(Pseudomonas aeruginosa).

Frente a los problemas presentados por la presencia del

mercurio en las aguas, los microorganismos pueden ser

biodetoxificadores muy eficientes de metales solubles y
particulados, especialmente a partir de concentraciones
externas diluidas, por esto las tecnologas basadas en los
microorganismos ofrecen una alternativa o ayudan a las
tcnicas convencionales para la eliminacin y recuperacin de
metales (Ehrlich, L. 1997).

Basndose en esto, se desarroll la investigacin como un

diseo de biofiltracin, el cual los microorganismos son los

responsables de la degradacin biolgica de los contaminantes
voltiles contenidos en corrientes de agua residuales (Alejandro
T., 2001).

METODOLOGIA DE PROCESO DE LABORATORIO

Las caracterizacin de las propiedades fsico-qumicas del sistema acutico.

Aislacin colonias tpicas de Pseudomona de las muestras colectadas en campo. en dos

diferentes medios de agar (agar f y King B) de la muestra tomada se inocularon 10ml al

90% de medio de cultivo.

Pruebas bioqumicas, las cuales consistieron en tres pruebas presuntivas y tres pruebas

confirmativas para la deteccin de Pseudomona aeruginosa.

Determinacin de la concentracin de mercurio tomando concentraciones de HgCl 2 al

0,7%, 1,0% y 2,0%, con el fin de realizar el escalamiento de volmenes mnimos de

capacidad biodetoxificadora .

Construy a escala de banco un biofiltro aerobio de arrastre por gravedad tomando como

base los estudios de (Caldern, 1999). Utilizando como soportes, evaluados en trminos
de volumen de saturacin, porosidad, y densidad, el carbn mineral, turba, escoria y
aserrn.

EL biofiltro con una concentracin HgCl2 (Cloruro de Mercurio II-) al 2%, se inoculo

Pseudomona aeruginosa por medio de aspersin con el propsito de determinar la

obtencin de una biopelcula sobre cada uno de los medios; obteniendo en cada uno de
ellos excepto el aserrn una pelcula blanquecina delgada (Alejandro T., 2001).

MARCO TEORICO
En la actualidad existen serios problemas de contaminacin

ambiental localizados en todos los niveles, como agua, suelo

y aire por consecuencia del desarrollo industrial. Que genera
una serie de contaminantes que alteran las condiciones
normales de los sistemas biolgicos, llegando en unos casos
a ser problemas irreversibles.
Segn el EPA, la "contaminacin del ambiente" significa

contaminaciones debido a la descarga (en cualquier medio

medioambiental) o el escape de cualquier sustancia de algn
procesos, que sea capaz de causar el dao al hombre o
cualquier otro organismo viviente presente en el ambiente

 En las ultimas dcada el desarrollo de la minera acufera que se localiza en los

sectores de las estribaciones externas de las cordilleras de los andes, han desarrollado
un acelerado desordenado e incontrolado crecimiento y al mismo tiempo generan
grandes daos al ambiente como la contaminacin del aire por la evaporacin de
mercurio, aguas contaminas por grandes descargas de este metal, cianuro y slidos
que contienen metales pesados. Adems de efectos ambientales tambin se han
generado problemas sociales como la presencia de poblaciones mineras, que carecen
de servicios elementales y se encuentras expuesto a un peligro de contaminacin. En
la poca de los 70 el sector industrial creci de forma acelerados situndose las
industrias en Quito y Guayaquil y en menor escala en Cuenca. Lo que ha incrementado
en estas ciudades grandes condiciones de contaminacin de los recursos hdricos por
compuestos qumico y metales, al aire por emisin de gases y los suelos por desechos
industrias. Los ros y esteros que cruzan entre estas ciudades soportan una gran
capacidad de compuestos contaminantes debido a un descuidado control de las aguas
negras que son vertidas sin tratamiento alguno los ros y esteros. (Examen Especial
Al Control De Explotacin Minera En Las Cuencas De Los Ros Santa Rosa,
Caluguro, Tenguel Y Siete, A Cargo De La Direccin Regional De Minera De El
Oro, Ministerio Del Ambiente Y Ministerio De Energa Y Minas, Ecuador)

 En los ltimos aos el deterioro ambiental en el pas, los problemas

legales, institucionales, econmicas que no estimulan la gestin

ambiental, ciencia y tecnologa, participacin de la poblacin civil,
educacin, no presente una poltica educativa e informativa en
materia ambiental, informacin y participacin de la poblacin civil.

 En los estudios realizados por el departamento de gestin ambiental

del municipio de Guayaquil, dado el monitoreo realizado en 27 de

Diciembre del 2007, en el Rio Gala aguas abajo del (recinto san Rafael)
demostraban que sus aguas se encontraban contaminadas por mercurio
y arsnico de acuerdo a los criterios de calidad admisibles para la
preservacin de la flora y fauna en agua dulce, segn Libro VI Anexo I
del texto unificado de la legislacin ambiental secundaria. Determino la
presencia de contaminantes en los sedimentos como cromo, mercurio,
cobre, arsnico, vanadio, nquel y cobalto. De los cuales el mercurio,
arsnico y vanadio superaban en 24.14, 12. Y 7.12 veces el lmite
mximo permisible determinado por los criterios de calidad del agua. En
el rio gala aguas abajo se presenta una contaminacin de menor grado
en los sedimentos (Informe del pas: Ecuador, reunin regional
sobre calidad de agua potable, OPS/CEPIS/REULAB, Mayo 1996)

El controlar y fiscalizar las operaciones hidrocarburferas y

mineras, promover la inversin nacional y extranjera,

precautelando los intereses del Estado Ecuatoriano. La
actividad minera en la zona examinada data de ms de treinta
aos. Existe un estudio de Monitoreo Ambiental de las reas
Mineras en el Sur de Ecuador llamado Sub-componente 3.1,
ejecutado por la Swedish Environmental System (SES)
durante el perodo de 1996 a 1998. La compaa indica que la
contaminacin relacionada con las actividades mineras en el
sur del Ecuador ha sido monitoreada y el impacto evaluado,
durante 5 ocasiones en los aos 1996-1998. Los estudios
incluyeron 4 reas de Ponce Enrquez, Santa Rosa, Portovelo
Zaruma y Nambija. Los principales medios investigados
fueron agua de ros y estuarios, sedimentos de ro y fauna
acutica.

 Los resultados del monitoreo indicaron que la minera ha causado

considerables impactos ambientales, siendo ms severos los de las

reas Portovelo-Zaruma y Ponce Enrquez. La descarga de los
contaminantes ha causado la extincin de toda la fauna acutica
superior en ciertos tramos de ros. Adems, en varios lugares, la
mala calidad del agua imposibilita su uso para consumo humano,
irrigacin o criaderos acuticos. Los metales pesados y el mercurio
son incorporados al medio con vida (bitico) de los ros y estuarios
afectados, sin embargo, el impacto de la minera en otras actividades
econmicas, como la produccin de bananas y el cultivo de
camarones, segn ese estudio de 1998, es considerada
insignificante. El mismo estudio seala que si los relaves fueran
confinados en diques de retencin adecuados, se podran solucionar
esencialmente todos los problemas referentes a la contaminacin
con metales pesados, mercurio y cianuro, determinndose como
prioritario para la mitigacin los ros Puyango, Siete y Gala Chico.

 En la actualidad la proteccin ambiental representa valores millones

a los $ 280 millones con predicciones a la alza de $640 billones para

el 2010. Estos valores van aumentando cada da. Estos valores
equivalen a la industria qumica mundial y es como si empleramos
a tres millones de personas. Por qu elegir un proceso biolgico
para el tratamiento de metales pesados en la industria ya parece
haber una gama completa de tecnologas?.
Debido a que
microorganismos tienen la capacidad para adaptarse a una variedad
de contaminantes, tanto orgnicos como inorgnicos, es importante
tener en cuenta desde el principio de que los microorganismos no
pueden destruir los metales

METODOLOGIA
DISEO EXPERIMENTAL
En el estudio propuesto se llevar a cabo con muestras recogidas

en el ro Gala, a estas muestras se les practicar una serie de

pruebas microbiolgicas para determinar las bacterias hetertrofas
de tipo pseudomona, Por medio de cultivos en placas con agar de
pseudomonas King A, se obtendrn las cepas puras.

Sistema de coordenadas
El eje X ser la zona

central del ro; el eje Y

se dirige a la derecha e
izquierda (anchura); y el
eje Z hacia debajo de la
superficie (profundidad)
respectivamente.

Mtodos de Muestreo de
Bacterias
El muestreo que se realizar ser tipo de estratificado, muy utilizado
en Ecologa.
Procedimiento:
Se tomaran muestras en tres puntos diferentes con el fin de abarcar
de forma horizontal el ro (x; y; z).
Las muestras sern tomadas con la botella de Van Dorf en la
superficie y a un metro mximo de profundidad.
Se realizar una coleccin en cada una de las pleamares y en cada
una de las bajamares.
Q=25.25m3/s 465Km2
Z = 4/3.75 pleamar Z = 0.35/0.20 bajamar:
Horario de muestreo.
Hora
Altura
hh:mm

Metros

00:30

3.64 P

06:30

0.76 B

12:00

3.61 P

19:30

0.78 B

Horario

Tipo de marea

# muestras Sup. y
Prof

3 puntos a la
horizontal

Replicas

00:30

3.64 P

12

06:30

0.76 B

12

12:00

3.61 P

12

19:30

0.78 B

12

24

48

Total

Toma de muestras

 Se usarn frascos de vidrio estriles de 250 ml de capacidad, y

frascos de DBO estriles de 250 ml para la parte profunda.

Despus del muestreo sern conservadas en refrigeracin.
A estas muestras se les harn una serie de filtraciones , para luego

cultivar las bacterias colectadas en placas de Agar de pseudomona

King A, con ello determinaremos el nmero de bacterias formadoras
de colonias, a partir de esto se cultivaran en un caldo de cultivo a las
colonias de pseudomona para la obtencin de cepas puras.

CONTEO
La lectura de los cultivos se la realizar 28H a partir de la siembra,
MICROBIOLOGICO
Se caracterizar morfolgicamente las colonias empleando la tincin
de Gram.
Cultivo de las bacterias.
Se sabe que el lmite mximo permitido de mercurio en ros
0.0002 mg/l
Rio gala (0.0002 x 24.14 veces mas del rango normal): 0.0048 mg/l

Equipos y Reactivos
Autoclave

Agar King A de

Cmara estril
Equipo de filtracin

pseudomonas
Agua destilada
Agua destilada
estril
Cloruro de mercurio

(Millipore)
pH-metro
Balanza
Cocineta
Incubadora

Materiales
Membranas de filtracin

Millipore de 0,45m.
Bomba de vaco
Pinzas estriles
Muestra de colonias
bacterianas
Asa de platino
Esptula de Drygalski
Mechero de alcohol
Micro-pipetas
Cajas de petri
Tubos de ensayo
Conos

Matraces
Guantes
Papel de empaque
Algodn
Alcohol potable
Tubos de 1.5 ml
Porta-tubos para tubos

de 1.5 ml
Porta tubos para tubos
de ensayo
Cinta adhesiva
Probeta

Pasos:
Cultivaremos las 48 membranas de filtrado en cada una de las cajas

petri con pseudomona agar King A, donde crecern en condiciones

de pH de 7 (+/-2). Al culmino de la incubacin contaremos las
colonias en sus respectivas membranas, consideraremos el
volumen filtrado y el factor de dilucin. Se seleccionarn las colonias
de pseudomonas desde los 48 agares cultivados.
Cultivaremos las colonias en medios lquidos, (cultivo puro).
Se realizar la mezcla del agar nutritivo con las respectivas
diluciones de cloruro de mercurio, y con una asa de platino se
tomar una pequea cantidad de colonia necesaria del caldo de
cultivo y se sembrar en un caja Petri que contenga medio slido
mezclado con cloruro de mercurio, rayndolo en forma de estras y
se las incubar en condiciones aerbicas.

Conversin
1000.000ml

1000 l

1ml
X l
0,001 l en 1ml de solvente = 1ppm
10 l en 1ml de solvente = 10.000ppm

Dilucin
Concentracin

100

10-1
10000ppm

10-2
1000ppm

Concentracin
real

10-3

10-5

10-6

100ppm

10ppm

1ppm

0.1ppm

0.01ppm

500ppm

50ppm

5ppm

0.5ppm

0.05ppm

50l

50l

50l

50l

1000l

1000
l

1000 l

1000 l

8000

8000

8000

8000

Volumen
1

---

---

50l

Volumen
final

---

---

1000 l

Total
(*8c/D)

10-4

8000

8 cajas petri

c/u 10-2

8 cajas petri

c/u 10-3

8 cajas petri

c/u 10-4

8 cajas petri

c/u 10-5

8 cajas petri

c/u 10-6

Total

40 cajas petri

 A partir del conteo se determinar que colonia y en cual dilucin,

ofreci mayor eficacia metalofijadora, segn la capacidad de

crecimiento de las UFC y se seleccionar dichas colonias.
Una vez realizados todos estos pasos, se procede a aplicar la

metodologa de la DGGE a cada una de las colonias seleccionadas.

METODO DE DGGE:
Para este mtodo de rastreo molecular, utilizaremos un equipo para

DGGE (electroforesis en gel con gradiente de desnaturalizacin),

para analizar poblaciones microbianas basadas en amplificaciones
de fragmentos de genes ribosomales (C.B.S Scientific. Co DGGE
2001- Rev. B).
Siguiendo el protocolo de (G. Muyzer, E.C. de Waal and A.G.

Uitterlinden. 1993.)lLa utilidad de sta diferenciacin radica en

donde hay mezclas de varios fragmentos de ADN con stas
caractersticas es muy comn cuando se amplifican fragmentos de
genes utilizando la tcnica PCR. Entonces para dicho efecto, nos
valdremos de un gel de poliacrilamida (6%) con gradiente qumico
lineal de 40 - 60% desnaturalizante (Urea-formamida). Se lo
condicionar a 60C de electroforesis 1020 voltios/5 h 150 voltios.

 Gracias al gen ribosomal de la subunidad 16S, y las variaciones en

ste gen, definirn los grupos taxonmicos de las bacterias que se

encuentran en una colonia especfica, las secuencias de estos
genes sern utilizados para la realizacin de los respectivos anlisis
de la composicin de comunidades microbianas en las muestras
ambientales recogidas.

Muestra recogida
del ro Gala

ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
DEL METODO DGGE

Extraccin de
ADN
DNA total, incluyendo
DNA microbiano de
especies diferentes
Amplificacin por PCR
de una regin variable
del ADN ribosomal
Mezcla de Amplicones
de ADN de diferentes
especies (mismo
tamao, pero
diferente secuencia

DGGE
anlisis
Muestra especfica
Huella Digital
-Banda
de
purificacin
y
secuenciacin.
-Anlisis de secuencia comparativa
con base de datos de secuencias
conocidas
Identificacin de
especies microbianas

EXTRACCIN DEL DNA Y PURIFICACIN

DEL DNA.
Para obtener el DNA completo aplicaremos el mtodo detallado por

Soluciones QPCR Protocolo y Tcnicas Cultek 02.2006; el mismo

que utiliza CTAB Fenol Cloroformo para la extraccin y
purificacin, e Isopropanol para lograr un buen precipitado.
El DNA lo purificaremos gracias a la tcnica puntualizada por Smit et

al., 1997, durante el cual se usar un Sistema de Purificacin

fundamentado en filtros (Wizard PCR Preps DNA Purification
System). El Kit comercial "Wizard genomic DNA purification kit"
[27], nos servir para purificar material gentico de las clulas de
cultivo bacteriano.

PCR (16SrRNA) DEL DNA

BACTERIANO

La amplificacin exponencial del DNA por PCR - DGGE permitir

obtener una cantidad suficiente de muestra para poder llevar a cabo

los anlisis subsecuentes, el cual lo realizaremos mediante la
tcnica ya descrita por Schaefer et al., (2001).
Las bacterias sern extradas a partir de los cultivos lquidos en

los cuales se las aisl previamente, estas cadenas de ADN sern

amplificadas por PCR - DGGE usando los primers PRBA338F-GC (5
GCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGA
CTCCTACGGGAGGCAGCAG-3) y 518R1 (5ATTACCGCGGCTGCTGG-3), complementarios de la regin
conservada 16S RNA, con 35 ciclos termales.

Tincin:
Para el proceso de la tincin se emplear la tincin SYBR Green I,

lo que nos permite determinar las muestras de una forma rpida

Lebaron et al. (2001) encuentran que las clulas teidas con SYBR
Green I tienen mayor fluorescencia y se obtiene mejor
discriminacin de la fluorescencia del fondo (ruido) en comparacin
con clulas teidas con otros flurocromos.
Una vez terminada la tincin, el gel ser fotografiado con ayuda de

una cmara digital (8 Megapixeles; con Zoom ptico).

Anlisis de Imagen:
Para el anlisis de los fragmentos y genotipado usaremos el

programa Gene Profiler y Adobe Photo Shop.

El software es un paquete completo que nos ayudar a detectar la
presencia de bandas en un gel, y calibrar los tamaos e intensidad
de los mismos.
Mediante el uso de marcadores de calibracin en cada serie de
electroforesis en gel, el Gene Profiler puede calcular
automticamente el peso, punto isoelctrico (pI.), y los valores de
concentracin de cualquier fragmento de ADN.
Adems el mdulo del software es capaz de corregir y analizar las
imgenes distorsionadas del gel, asegurando el ms alto grado de
precisin posible.

Diseo Experimental

Muestras de
agua
provenientes
del ro Gala

Microbiologa,
medio selectivo
(pseudomona agar
Kin A)

Ensayo: Cultivo
de cepas en la
mezcla agarmercurio

Primer
aislamiento de
Cepas

Anlisis del ensayo

(cepa con mayor
capacidad
metalofijadora

Segundo
aislamiento (Cepa
metalofijadora)

PCR

Extraccin de
ADN

Amplificado
16S rRNA de
toda la
poblacin
bacteriana

Electroforesis en gel con

gradiente desnaturalizante
(DGGE)
Anlisis del
patrn de
bandas

Caracterizacin
bacteriana

ndices de Diversidad
Empleando los ndices de diversidad podremos

examinar la
estructura de la comunidad bacteriana muestreada, cuyos clculos
se resolvern con distintas formulas para establecer las
poblaciones, a partir de los resultados arrojados de la tcnica
DGGE.

Riqueza de especies (S):

Segn (LUDWIG Y REYNOLDS 1988) consiste en la cantidad de

especies existentes en un rea determinada. La abundancia est

dada por la cantidad de especies (bandas) observados en total. Este
ndice define el nmero de organismos que se encuentran presentes
en una muestra (nmero de bandas presentes en DGGE). [28] No
toma en cuenta la proporcin y distribucin de cada especie en la
comunidad, se refiere a un anlisis meramente cuantitativo.
Se calcula con la siguiente ecuacin:
S= # de bandas detectadas

ndice de Shannon
Weaver:
Este ndice representa a los individuos que se muestran al azar a
partir de una poblacin "indefinidamente grande".
La ventaja de este ndice es que l lleva en consideracin el nmero
de las especies y las especies dominantes. En este caso se calcula
en base a las bandas de los perfiles obtenidos del DGGE, o sea que
toma en cuenta el nmero y la intensidad relativa de las bandas
(Koizumi, 2003) [28].
Se calcula por medio de la siguiente ecuacin:
Donde:
es la intensidad relativa de las bandas en un perfil.

Igualdad u homogeneidad (Evenness)

Si todas las especies en una muestra (nmero de bandas

presentes en DGGE) presentan la misma abundancia

(intensidad relativa de las bandas) el ndice usado para medir
la de equitabilidad debera ser mximo y, por lo tanto, debera
decrecer tendiendo a cero a medida que las abundancias
relativas se hagan menos equitativas [29]. Hurlbert (1971).
El clculo se realiza a partir del ndice de riqueza de especies
(S) y el ndice de Shannon-Weaver (H).
Se calcula con la siguiente ecuacin:

Diseo estadstico sobre los resultados

arrojados por los ndices de diversidad.
Para estimar estadsticamente la diversidad se debe:
Tener un buen conocimiento de la composicin

taxonmica.
Considerar que todos los individuos asignados a una clase
(especie) son idnticos. Es decir, no se reconoce la
variabilidad que puede existir, por ejemplo: etapas del
desarrollo de la bacteria (quiste-espora etapa vegetativa,
etc).
La diversidad en una muestra bacteriana es una variable
nominal, las categoras son las especies y por lo tanto el nico
valor de tendencia central que puede obtenerse es la moda
(categora con mayor frecuencia, en este caso la especie ms
abundante), siendo imposible calcular un promedio o una
mediana.

ANLISIS DEL PROYECTO

Analizar la importancia de este estudio y los impactos positivos, que

podran tener en las poblaciones aledaas, como al desarrollo

cientfico del pas.

Tenemos la confianza de la presencia microorganismos con

capacidad metalo-fijadora, debida a que las aguas del ro se

encuentran contaminadas con mercurio y dems metales, gracias a
la accin minera, el cual es un sustento para la poblacin de
Tenguel.

INTERPRETACIN DE RESULTADOS
Se espera que mediante el implemento de la tcnica de DGGE, para la

caracterizacin de las bacterias, se pueda determinar la predominancia

microorganismos, en especial la existencia de gneros pseudomona en el
ro Gala, para el uso de las mismas en futuros procesos de biorremediacin.

La aislacin ulterior de las bacterias, con mayor potencialidad de resistencia

y fijacin al mercurio, para lograr la obtencin, mantenimiento y

almacenamiento de cepas puras.

Utilizar las cepas puras aisladas para estudios posteriores y pruebas

bioqumicas sobre su capacidad metalo-fijadora.

Se establecer una lnea base de la presencia de los microorganismos

presentes en el Rio Gala y as contribuir con el desarrollo tecnolgico y

cientfico, vinculados con los procesos de remediacin ambiental y
tratamientos de residuos txicos, por parte de la industria minera.

CONCLUSIONES Y
RECOMENDACIONES
Mediante la caracterizacin bioqumica, se han implementando

medios de cultivos selectivos, pruebas de resistencia y mtodos de

fijacin de mercurio se pudo determin bibliogrficamente que los
gneros pseudomonas
predominaban en zonas con altas
concentraciones de metales pesados.

Dadas las caractersticas biolgicas de estos microorganismos

(gnero Pseudomona), se asumi la existencia de las mismas en el

rio Gala. Debido a que se encuentran distribuidas de manera amplia
en suelos y aguas contaminadas con metales pesados.

Gracias a las tcnicas moleculares (PCR-DGGE), se puede

determinar especficamente el nmero y especie presentes en las

muestras, y definir las especies dominantes dentro de las cepas
aisladas.

CRONOGRAMA DE
ACTIVIDADES.
ACTIVIDADES
ENE
Toma de las muestras (aguas
abajo del Rio Gala)
Transporte
muestras.

preservacin

de

Cultivo de las muestras em agar

selectivo
A

Anlisis de las colonias del

genero
gnero pseudomona

Obtencin de cepas puras, en

medio liquido de cultivo.

Bioensayo en Agar/Mercurio
Anlisis de los crecimientos
obtenidas en los distintos cultivos
agar/mercurio

Aislamiento de la UFC con mayor

actividad metalofijadora

Caracterizacin por el mtodo

PCR- DGGE

Anlisis de los ndices

diversidad y de resultados

de

Escritura de publicacin/ es de
resultados

FEB

MAR

ABR

MAY

JUN

JUL

AGO

SEP

OCT

NOV

DIC

No.

ACTIVIDAD

Toma de las muestras (aguas abajo

del Rio Gala)

RECURSOS

RECURSOS

MATERIALES

HUMANOS

Botellas Boeco-Germany con

tapa rosca de 250 ml.

tcnico para toma de

Botella Van Dorf

muestras

Canoa

1 Panguero

FECHA INICIO

3 das

COSTO DE LA
ACTIVIDAD

768,60

Hielera

Transporte y preservacin de

Transporte: Automotor,

muestras.

Chofer.

14000

2 Biotecnolo-gos

123,00

combustible.
Cajas petri

Cultivo de las muestras

1 Mes

Agar pseudomona King A

Varios

5
6

Anlisis de las colonias del genero

pseudomona
Obtencin de cepas puras, en
medio liquido de cultivo.

1 mes

Enero

Biotecnolo-gos
TSB

200,00

44,00

500g

Bioensayo en Agar/Mercurio

200,00

Anlisis de los crecimientos

7

obtenidas en los distintos cultivos

120,00

agar/mercurio
8

9
10
11
12

Aislamiento de la UFC con mayor

-----

actividad metalofijadora
Caracterizacin por el mtodo PCRDGGE
Anlisis de los ndices de
diversidad

-Equipo

DGGE

6800,00

-Kit de extraccin
Ordenadores

1250,00

Escritura de publicacin/ es de

Ordenadores y material de

resultados

oficina

Alquiler de laboratorio de

88000,00

microbiologa
COSTO TOTAL PROYECTO

500,00

98145,60

Fin