Validación Tallerinha

ELABORACIN DE UNA GUA PARA
EL ESTABLECIMIENTO DEL CONTROL

DE CALIDAD INTERNO EN LOS
LABORATORIOS DE MICROBIOLOGA
DE ALIMENTOS DE LA RED
NACIONAL DE LABORATORIOS DE
ANLISIS DE ALIMENTOS DE CUBA
VALIDACIN DE MTODOS MICROBIOLGICOS
rC. Claudio Rodrguez Martnez (claudio@biocen
VALIDACIN DE MTODOS
MICROBIOLGICOS
VALIDACIN: Proceso que establece,

mediante estudios de laboratorio, que
las caractersticas de desempeo del
procedimiento cumplen los requisitos
para
las
aplicaciones
analticas
previstas.
Confirmacin, mediante el suministro de
evidencia objetiva, de que se han cumplido los
requisitos para una utilizacin o aplicacin
especfica prevista.
Establecimiento de las caractersticas de
desempeo de un mtodo y la provisin de
evidencias objetivas de que los requerimientos
particulares para el uso deseado especificado
se han alcanzado.
USP XXXVI.2013
International Standard ISO. Draft EN ISO/CD 16140-1. 2011. Microbiology of food and animal feeding stuffs Method validation
- Partdel1:
Terminology
of method.
Documento propiedad
autor.
Prohibida su reproduccin
por cualquier medio para fines distintos a la imparticin de este curso sin la aprobacin de su autor por escrito.
VERIFICACIN: Evaluacin que sirve para

determinar si el procedimiento puede ser
utilizado para su propsito previsto, en las
condiciones de uso reales para un frmaco
especfico y/o matriz de un producto
farmacutico.
Confirmacin mediante el aporte de evidencia

objetiva de que se han cumplido los requisitos
especificados.
Demostracin de que el mtodo validado
funciona en manos del usuario de acuerdo
con las especificaciones del mtodo,
determinada en un estudio de validacin y
cumple con el propsito.
Provisin de evidencia objetiva de que el
item (artculo) dado cumple con los
requerimientos especificados.
USP XXXVI.2013.
nternational Standard ISO. Draft EN ISO/CD 16140-1. 2011. Microbiology of food and animal feeding stuffs Method validation
- Partdel1:
Terminology
of method.
Documento propiedad
autor.
Prohibida su reproduccin
por cualquier medio para fines distintos a la imparticin de este curso sin la aprobacin de su autor por escrito.
REQUISITOS GENERALES PARA LA

VALIDACIN Y ACEPTACIN DE LOS
MTODOS MICROBIOLGICOS
ALTERNATIVOS
(Para los
mtodospara
de
Se
establecen los lmites
de deteccin
las matrices ensayadas
de manera rutinaria.
deteccin)
Se determina la probabilidad de la deteccin
a bajos niveles como el indicador de la
incertidumbre de estos ensayos.
Se documenta la sensibilidad y especificidad
del mtodo alternativo para
microorganismos diana y cualquier
limitacin conocida del mismo.
Se establecen los controles de medios,
pruebas diagnsticas y reactivos.
Se demuestra la consistencia en la
interpretacin entre analistas.
Rodrguez Martnez C. 2010. Validacin de mtodos microbiolgicos alternativos. Curso pre-evento. XV Convencin
Cientfica de Ingeniera
y Arquitectura.
ISPJAE.porCuba.
Documento propiedad
del autor. Prohibida su reproduccin
cualquier medio para fines distintos a la imparticin de este curso sin la aprobacin de su autor por escrito.
(Para los mtodos de confirmacin,

identificacin y caracterizacin)
Establecimiento de la sensibilidad y
especificidad.
Comprobacin de cualquier limitacin
declarada para determinado
microorganismo diana.
Control del desempeo de los reactivos
y su vida til.
Control del desempeo de los
equipos.
Demostracin de la
consistencia en la
interpretacin entre analistas.
Cientfica de Ingeniera y Arquitectura. ISPJAE. Cuba.
Documento propiedad del autor. Prohibida su reproduccin por cualquier medio para fines distintos a la imparticin de este curso sin la aprobacin de su autor por escrito.
Mtodos
cualitativos
Mtodos
cuantitat
ivos
Exactitud
Presicin
Especificidad
Lmite de deteccin
Lmite de cuantificacin
Linealidad
Intervalo operativo
Robustez
Repetibilidad
Tolerancia
Parmetros de la validacin
USP XXXVI.2013
Para la validacin de un mtodo

alternativo se requiere:
Estudio de comparacin con mtodo
Ensayos
estndar reconocido
Ensayos cuantitativos
cualitativos
Ejercicio interlaboratorial
Lmite
deteccin
Recuento de
de
microorganismos
totales
Sensibilidad
Repetibilidad +
Precisin
intermedia
Especificidad
Lmite de
cuantificacin
Inclusividad
Rango
Recuento de
microorganismos en
medio
selectivo/diferencial
Repetibilidad +
Precisin intermedia
Lmite de
cuantificacin
Rango
Incertidumbre de Incertidumbre de la
Exclusividad
International Standard ISO. Draft EN ISO/CD
16140-1. 2011.
la medicin
medicin
Microbiology of food and animal feeding stuffs - Method
validation - Part 1: Terminology of method.
Gua para la validacin de mtodos microbiolgicos.

Robustez
Robustez
Organismo Argentino de Acreditacin. DC-LE-08. 2011.
Robustez
Sensibilidad
Mtodos
cualitativos
Parmetros de la
validacin
Mtodos
cuantitativos
alternat
ivo
nuevo
alternati
vo
nuevo
Campo de aplicacin
Especificidad
Sensibilidad
Exactitud
Exactitud relativa
Repetibilidad
Lmite de deteccin
Lmite
determinacin
Conformidad
estadstica
de
X
X
X
X
Tasa
de los falsos
Guide pour la validation de mthodes dessais microbiologiques
et lvaluation
de leur incertitude de mesure dans
X
X
les
domaines
de
la
microbiologie
alimentaire
et
de
lenvironnement.
Document
N
328.fw Edition fvrier 2006, rv.
positivos
01. Dpartement fdral de lconomie DFE. Secrtariat dEtat lconomie SECO. Service daccrditation suisse
SAS
Para la validacin de un mtodo interno se

Para la validacin de un mtodo interno se
requiere:
requiere:
Estudio de comparacin con un mtodo estndar

reconocido ms amplio (la Norma ISO 16140, la
Norma ISO/TR 13843, o los protocolos de USP,
AOAC, NordVal, entre otros).
International Standard ISO. Draft EN ISO/CD 16140-1. 2011. Microbiology of food and animal feeding stuffs Method validation - Part 1: Terminology of method.
Gua para la validacin de mtodos microbiolgicos. Organismo Argentino de Acreditacin. DC-LE-08. 2011.
Para la validacin y aceptacin de los mtodos

Para la validacin y aceptacin de los mtodos
alternativos que no han sido validados contra un
alternativos que no han sido validados contra un
Estndar Internacional, o sea, empleando un
Estndar Internacional, o sea, empleando un
mtodo
de
referencia
no
reconocido
mtodo
de
referencia
no
reconocido
internacionalmente se exige:
internacionalmente se exige:
Sea conducido segn protocolo de validacin
aprobado por un panel tcnico de revisores y sus
resultados aceptados por ellos.
Revisores tcnicos que operan con auspicio de
organizaciones internacionalmente reconocidas
que ejecutan validaciones de mtodos.
Los estudios responden al menos al total del
nmero de muestras y de matrices
requeridas.
Para la validacin y aceptacin de un mtodo

Para la validacin y aceptacin de un mtodo
alternativo que ha sido modificado despus de
alternativo que ha sido modificado despus de
haber sido validado con anterioridad contra un
haber sido validado con anterioridad contra un
Estndar Internacional:
Estndar
Internacional:
Evaluacin
por un panel de expertos si el cambio es
mayor y se procede a validar contra mtodo de
referencia (si impacta negativamente en la
exactitud de los resultados se rechaza).
Si el cambio es menor se ejecuta un estudio de

comparacin de mtodos reducido (ISO 161403 matrices de alimentos y/o muestras
ambientales).
Otros cambios menores y no afectan el
protocolo del mtodo, no requieren de la
validacin.
mbios mayores en un mtodo microbiolgico

Nueva matriz de ensayo
Porcin de ensayo o suspensin inicial
diferente
Parmetros de incubacin
Equipos con diferente tolerancia
Mtodo de recuento diferente
Rango de recuento diferente
Mtodo
diferente
de
clculo
y
expresin de resultados
Diferente nmero de placas para
recuento
Combinacin de pasos de un mtodo
normalizado con pasos de un mtodo
descrito en la bibliografa relevante
Para la verificacin de un mtodo estndar se

Para la verificacin de un mtodo estndar se
requiere un protocolo reducido:
requiere un protocolo reducido:
Mtodo cualitativo - lmite de deteccin y
verificacin de la sensibilidad y especificidad.
Mtodo cuantitativo repetibilidad y precisin

intermedia, lmite de cuantificacin y
verificacin de la veracidad.
USP XXXVI. 2013.
VALIDACIN
PRIMARIA:
tiene
por
objetivo
evaluar
o
mejorar
el
desempeo
del
mtodo
en
el
laboratorio.
Los resultados de diferentes analistas
y laboratorios se comparan entre s o
con los valores de referencia asignados.
Nmero limitado de muestras en una
matriz bien definida.
Puede permitir la evaluacin de la
robustez del mtodo, la claridad de los
procedimientos escritos y la posibilidad
de uso ms amplio.
Method Validation of U.S. Environmental Protection Agency Microbiological Methods of Analysis. EPA Forum on
Environmental Measurements (FEM) Microbiology Action Team. FEM Document Number 2009-01 October 7, 2009.
VALIDACIN
objetivos:
SECUNDARIA:
tiene
por
proveer especificaciones para los

atributos de desempeo del mtodo en
una
muestra
representativa
del
conjunto de laboratorios que se espera
utilicen el mtodo para el propsito
deseado.
demostrar la equivalencia
mtodo de referencia.
con
el
Method Validation of U.S. Environmental Protection Agency Microbiological Methods of Analysis. EPA Forum on
Environmental Measurements (FEM) Microbiology Action Team. FEM Document Number 2009-01 October 7, 2009.
ROTOCOLO DE VALIDACIN
Captulo
Contenido
Ttulo
Nombre del mtodo que se pretende validar
Objetivo
Alcance, parmetros y analitos
Campo de
aplicacin
Tipos de productos (matrices)
Mtodo de
ensayo
Diagrama de flujo o esquema, descripcin detallada
Equipamiento
Equipos, condiciones metrolgicas, etc.
Personal
Calificacin, habilidades, desempeo, tareas

especficas
Materiales
Materiales a emplear
Reactivos y
medios
Nombres y calidad, medios, cepas, preparacin de

inculos
Muestras
Caractersticas, almacenamiento, cantidades,

preparacin
Desarrollo de la
validacin
Descripcin de cada experimento en detalle
Resultados
Registros, tablas
Anlisis
Rodrguez Martnez C. 2010. Validacin
de mtodos
microbiolgicos
alternativos.
Curso pre-evento. XV Convencin
Anlisis
a Cuba.
aplicar
para cada
parmetro
Cientfica
de
Ingeniera
y
Arquitectura.
ISPJAE.
estadstico
MERO DE LABORATORIOS (ISO 16140)

ALIMENT
OS
FASE I
Por el laboratorio
organizador
FASE II
Inter-laboratorio
De 5, 8 a 15
laboratorios con
resultados vlidos
International Standard ISO 16140. 2003. Microbiology of food and animal feeding stuffs - Protocol for the validation
of alternative method.
MATRICES
Sin
contamina
cin
Naturalme
nte
contamina
das
Procesados (estresados):
por desecacin
por calor
por pH
por bajas temperaturas
por aw
Artificialmente
contaminadas
Prioridad en el tipo:
1. Artificialmente
contaminadas por
mezcla
2. Artificialmente
contaminadas por
inoculacin
3. Materiales
certificados
MUESTRAS (ISO 16140)

ESTUDIO PAREADO
(MUESTRAS
CASADAS, DATOS
PAREADOS)
Ambos mtodos
tienen un primer
paso comn para el
enriquecimiento
ESTUDIO NO
PAREADO
(MUESTRAS NO
CASADAS, DATOS
NO PAREADOS)
Ambos mtodos no
tienen un primer
paso comn
estras para estudios de comparacin de mtod

(ISO 16140)
Para cada tipo de
alimentos:
20 muestras
Para cada categora:

60 muestras
Idealmente:
10
muestra
s
positivas
5 niveles,
mnimo:
10
muestra
s
negativa
pero
como
s
Niveles:
1. Ausen
cia
2. Bajo
3. Medio
4. Alto
International Standard ISO. Draft EN ISSOCD 16140-2. 2011. Microbiology of food and animal feeding stuffs Protocol
for the validation of alternative method Part 2: Protocol for the validation of alternative (proprietary) methods
against a reference method.
EXACTITUD RELATIVA (AC):

Grado de correspondencia entre la
respuesta obtenida por el mtodo de
referencia y la respuesta obtenida por el
mtodo alternativo en muestras
idnticas.
Exactitud relativa=
VP
+ VN
(VP + FP + VN + FN)
En porcentaje=
x 100%
VP + VN
(VP + FP + VN +
FN)
International Standard ISO. Draft EN ISO/CD 16140-1. 2011. Microbiology of food and animal feeding stuffs - Method
International Standard ISO. Draft EN ISO/CD 16140-2. 2011. Microbiology of food and animal feeding stuffs
Protocol for the validation of alternative method Part 2: Protocol for the validation of alternative (proprietary)
methods against a reference method.
SENSIBILIDAD (para un tipo de matriz y

un nivel de inoculacin dado): fraccin
del nmero total de cultivos o colonias
positivos que son correctamente
asignados con el mtodo utilizado.
Capacidad de un mtodo de detectar el
microorganismo diana, cuando ste est
presente.
Sensibilidad=
VP___
VP + FN
En porcentaje=
VP
x 100%
VP + FN
ESPECIFICIDAD (para un tipo de matriz y

un nivel de inoculacin dado): fraccin
del nmero total de cultivos o colonias
negativos que son asignados
correctamente con el mtodo utilizado.
Capacidad de un mtodo de no detectar
el microorganismo diana, si ste no est
presente.
Especificidad=
VN___
VN + FP
En porcentaje=
VN
x 100%
VN + FP
Criterio de aceptacin:
No menos del 10
International Standard ISO. Draft EN ISO/CD 16140-1.
2011. Microbiology of food and animal feeding stuffs - Method
- 30%
NDICE KAPPA
Los resultados de los ensayos cualitativos son
analizados para comprobar la concordancia.
a=2x
((VP x VN) (FN x FP))
[(VP + FP ) x (FP+VN)] + [(VP + FN) x (FN + VN
SULTADOS DISCORDANTES (IS0 16140)

Se analizan los resultados discordantes
por el test de
McNemar, empleando el
recuento de las desviaciones positivas
(PD) y las desviaciones negativas (ND).
Primeramente
se
cuenta
el
nmero
resultados discordantes (Y) como sigue:
de
Y=PD +
ND
Para Y < 6, (menos de 6 desacuerdos): no existe

ningn test disponible.
El test se aplica a muestras pareadas, no es robusto para
muestras no pareadas
LMITE DE DETECCIN: nmero ms bajo

MITE DE DETECIN RELATIVO (IS0 16140)
de microorganismos en una muestra que
puede detectarse bajo las condiciones
experimentales establecidas
Lmite de deteccin (LOD): valor cuantitativo
medido, obtenido por un procedimiento dado de
medicin, para el cual, la probabilidad de
declarar falsamente la ausencia de un
componente en un material es , dada una
probabilidad de reclamar falsamente su
presencia.
Se recomienda un valor de 0,05 para y

.
Concentracin de analito a la cual la
probabilidad de deteccin (POD) es igual
al 50%.
USP XXXVI. 2013.
INCLUSIVIDAD: capacidad de un mtodo

alternativo de detectar el
microorganismo diana a partir de un
amplio rango de cepas.
La inclusividad es el rango de cepas que refleja
La inclusividad es el rango de cepas que refleja
la diversidad gentica y/o serolgica del
la diversidad gentica y/o serolgica del
microorganismo diana que el mtodo puede
microorganismo diana que el mtodo puede
detectar.
detectar.
Amplio rango de cepas diana debidamente
Amplio rango de cepas diana debidamente
caracterizadas
gentica-,
serolgicay/o
caracterizadas
gentica-,
serolgicay/o
bioqumicamente, para identificarlas con plena
seguridad,
provenientes
de
muestras
seguridad,
provenientes
de
muestras
contaminadas y si es necesario, se emplearn
aisladas
con16140-1.
antelacin
deand las
matrices
cepas
International Standard
ISO. Draft EN ISO/CD
2011. Microbiology of food
stuffs - Method
cepas
con antelacin
de animal
lasfeeding
matrices
validation
- Part 1: aisladas
Terminology of method.
International
Standard ISO.y/o
Draft EN
ISO/CD 16140-2.
2011. Microbiology of foodde
and animal
feeding stuffs
estudiadas
cepas
certificadas
coleccin.
Protocol
for
the
validation
of
alternative
method
Part
2:
Protocol
for
the
validation
of
alternative
(proprietary)
estudiadas y/o cepas certificadas de coleccin.
EXCLUSIVIDAD: capacidad del mtodo de

no detectar a los microorganismos no
diana, es decir aquellos que pueden
presentar reacciones cruzadas con el
microorganismo diana.
30 cultivos puros relevantes para el mtodo
30 cultivos puros relevantes para el mtodo
alternativo, y los productos alimenticios y
alternativo, y los productos alimenticios y
matrices sometidos a ensayo.
matrices sometidos a ensayo.
Amplio rango de cepas no diana debidamente
Amplio rango de cepas no diana debidamente
caracterizadas
gentica-,
serolgicay/o
caracterizadas
gentica-,
serolgicay/o
seguridad,
provenientes
de
muestras
seguridad,
provenientes
de
muestras
cepas aisladas con antelacin de las matrices
cepas aisladas con antelacin de las matrices
International
Standard ISO.y/o
Draft ENcepas
ISO/CD 16140-1.
2011. Microbiology of food de
and animal
feeding stuffs - Method
estudiadas
certificadas
coleccin.
validation
Part
1:
Terminology
of
method.
estudiadas y/o cepas certificadas de coleccin.
PERFIL
DE
EXACTITUD.
ESTUDIO
DE
PERFIL
DE
EXACTITUD.
ESTUDIO
DE
COMPARACIN DE MTODOS
COMPARACIN
DEtipos
MTODOS
i nmero de
de muestras (1 i 6)
j nmero de rplicas (1 j 4)
Xi log del resultado del mtodo de referencia
Zi log del resultado del mtodo alternativo
Para cada muestra las mediciones se
ejecutan bajo condiciones de repetibilidad.
Se asume distribucin normal de los
resultados.
Se establece el criterio de aceptabilidad

como log unidades (es una diferencia
por el empleo de logaritmos).
methods against
a reference
method.
Documento
propiedad del autor.
Prohibida su reproduccin por cualquier medio para fines distintos a la imparticin de este curso sin la aprobacin de su autor por escrito.
Intervalo de aceptabilidad
-intervalo de tolerancia esperado
Representacin simultnea del intervalo de aceptabilidad y del -ETI para una

muestra de un item de un slo alimento durante la validacin (tomado de la ISO
16140)
LMITE DE CUANTIFICACIN: nmero ms

bajo de m.o. que pueden contarse con
exactitud.
LMITE DE CUANTIFICACIN (LOQ): nmero
mnimo de microorganismos dentro de una
variabilidad definida que puede determinarse en
las condiciones experimentales del mtodo
evaluado.
(LQ): menor cantidad de analito en una muestra
laboratorial, que puede ser determinada
cuantitativamente con una confianza definida.
Tambin llamado lmite de

determinacin.
USP XXXVI. 2013.

Linealidad con respecto al volumen

Gn 1
c1
c2
cn
2 c1 ln
c2 ln
.... cn ln
c ln
R1
R2
Rn
c
R
Volumen de
muestra
Recuento 1,
UFC/ placa
Recuento 2,
UFC/ placa
Recuento 3,
UFC/ placa
Volumen
relativo Vri
0,2 ml
46
45
46
0,1 ml
16
16
16
0,2 ml
44
44
44
0,1 ml
18
18
18
0,2 ml
45
46
46
0,1 ml
16
16
16
0,2 ml
45
45
45
0,1 ml
18
18
18
OTROS PARMETROS
Reproducibilidad
Repetibilidad
Sesgos
Rango
Proporcionalidad
Robustez
Rudeza
Selectividad Real
Selectividad aparente

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ELABORACIN DE UNA GUA PARA

EL ESTABLECIMIENTO DEL CONTROL

rC. Claudio Rodrguez Martnez (claudio@biocen

VALIDACIN: Proceso que establece,

VERIFICACIN: Evaluacin que sirve para

Confirmacin mediante el aporte de evidencia

REQUISITOS GENERALES PARA LA

(Para los mtodos de confirmacin,

Para la validacin de un mtodo

Gua para la validacin de mtodos microbiolgicos.

Para la validacin de un mtodo interno se

Estudio de comparacin con un mtodo estndar

Para la validacin y aceptacin de los mtodos

Para la validacin y aceptacin de un mtodo

Si el cambio es menor se ejecuta un estudio de

mbios mayores en un mtodo microbiolgico

Para la verificacin de un mtodo estndar se

Mtodo cuantitativo repetibilidad y precisin

proveer especificaciones para los

Nombre del mtodo que se pretende validar

Alcance, parmetros y analitos

Tipos de productos (matrices)

Diagrama de flujo o esquema, descripcin detallada

Equipos, condiciones metrolgicas, etc.

Calificacin, habilidades, desempeo, tareas

Nombres y calidad, medios, cepas, preparacin de

Caractersticas, almacenamiento, cantidades,

Descripcin de cada experimento en detalle

MERO DE LABORATORIOS (ISO 16140)

MUESTRAS (ISO 16140)

estras para estudios de comparacin de mtod

Para cada categora:

EXACTITUD RELATIVA (AC):

SENSIBILIDAD (para un tipo de matriz y

ESPECIFICIDAD (para un tipo de matriz y

SULTADOS DISCORDANTES (IS0 16140)

Para Y < 6, (menos de 6 desacuerdos): no existe

LMITE DE DETECCIN: nmero ms bajo

Se recomienda un valor de 0,05 para y

INCLUSIVIDAD: capacidad de un mtodo

EXCLUSIVIDAD: capacidad del mtodo de

Se establece el criterio de aceptabilidad

-intervalo de tolerancia esperado

Representacin simultnea del intervalo de aceptabilidad y del -ETI para una

LMITE DE CUANTIFICACIN: nmero ms

Tambin llamado lmite de

USP XXXVI. 2013.

Linealidad con respecto al volumen

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