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Eletroforese
Diversos mtodos para anlise de:
cidos nuclicos (DNA e RNA)
Protenas
Enzimas
ETAPAS
Preparar a amostra (DNA total, Produtos de PCR,
Protenas, etc...)
Preparar o gel
Aplicar as amostras no gel
Eletroforese
Colorao do gel, Fixao, Documentao
CLASSIFICAO
Tipos:
- agarose
- poliacrilamida
desnaturante
no desnaturante
- amido (para isoenzimas)
Princpios:
- carga eltrica e tamanho da molcula (partcula)
- pH (focalizao isoeltrica)
Deteco:
brometo de etdeo, SYBR, nitrato de prata,
fluorescncia
substratos especficos (isoenzimas)
Visualizao:
UV, direta, cmera
Eletroforese
Eletroforese
Syber green
http://www.probes.com/servlets/product?region=0&item=7563
cidos Nuclicos
cido nuclico exposto a campo eltrico
migra para eletrodo na velocidade ou
mobilidade proporcional a fora do campo e
a carga lquida da molcula
mobilidade: inversamente proporcional ao
coeficiente friccional
coeficiente friccional: funo do tamanho e
forma da molcula e viscosidade do meio
Eletroforese
Molculas separadas por:
tamanho
forma ou conformao
magnitude de cargas
Eletroforese
Eletroforese
Tamanho da Molcula de DNA
DNA linear migra inversa/ proporcional ao log10
do seu peso molecular
Eletroforese
AGAROSE:
polissacardeo linear de galactose com
unidades de -D-galactopiranose com ligaes
1,3 e 3,6-anidro-a-L-galactopiranose
PM mdio: 120.000 Da
Agarose
Eletroforese
Tampes: gua eletrolisada gerando H+
no anodo e OH- no catodo
terminal catdico (+) -> bsica
terminal andico (-) -> cida
Eletroforese
Tampo
Aplicao e comentrios
TAE
TBE
Eletroforese
TAE
TBE
preferido para molculas menores < 1Kb
interage com agarose - poros menores
Eletroforese
Voltagem
expressar sempre em V cm-1
gradiente de voltagem - distncia entre eletrodos
voltagem excessiva - rastro de banda
voltagem baixa - difuso de bandas pequenas <1 Kb
TBE - bandas pequenas mais finas
TAE - bandas maiores
Eletroforese
Tamanho
Voltagem
< 1 kb
Tampo
Recuperao
Anlise
5 V/cm
TAE
TBE
1 to 12 kb
4-10 V/cm
TAE
TAE/TBE
> 12 kb
1-2 V/cm
TAE
TAE
Eletroforese
Tempo de corrida
correr gel at banda de interesse ter migrado de
40 a 60% do comprimento do gel
parte inferior do gel - difuso e disperso
Eletroforese
Tampo de Carregamento:
Concentrao 6 a 10x
aumentar densidade da amostra - depositar
amostra no fundo do poo
adicionar cor a amostra
adicionar corantes de mobilidade ou migrao
azul de bromofenol
xileno cianol
verde de bromocresol
EletroforesePoliacrilamida
GEL DE POLIACRILAMIDA
- Gis de Poliacrilamida so obtidos a partir da formao
de ligaes entre o polmero acrilamida e o co-monmero
bis-acrilamida.
- Essa reao covalente geralmente catalizada por
persulfato de amnio e iniciada por TEMED, uma amina
terciria.
- Uma ampla faixa de tamanho de poros pode ser obtida
atravs de variaes de:
Concentrao de acrilamida e bis-acrilamida
Grau de polimerizao
GEL DE POLIACRILAMIDA
- A matriz de poliacrilamida por possuir poros
menores do que a matriz de agarose, gis de
acrilamida so usados para separar fragmentos de
DNA menores que 2 kpb, enquanto que molculas de
at 200 kpb podem ser separaradas em gis de
agarose.
- De forma geral, um gel de 12 cm, a 1% de agarose
separa fragmentos na faixa de 30 a 0,2 Kbp,
enquanto que a 7,5% de poliacrilamida separa entre 1
a 0,05 Kpb.
Eletroforese
ACRILAMIDA DESNTAURANTE
- Acrscimo de Uria no gel para a manuteno do DNA na
forma de fita simples
- Amostras de DNA so desnaturadas a 94 -96o C, na
presena de Formamida, antes da eletroforese