BIOLOGIA Y

CLONACION
MOLECULAR DEL
SECUENCIAMIENTO
ADN
INTEGRANTES:

Badillo Eguavil, Hildalidia

Calle Luque Gemma.
Cndor Caldern Hermelinda
Chinchay Espinoza Rosa E.
Intiquilla Medrano, Sandibell
Juregui Valdez , Mariella
Lavado Ordoez , Patricia
Merca Rojas , Yanett
Montoya Huamn, Mariangelica
Sucasaca Quispe, Dianeth
Urco Chuquillanqui, Sandra

DOCENTE:
MINAYA GALARRETA, ANGELICA KARINA

CLONACION DEL
ADN MOLECULAR

RESEA HISTORICA

En los aos 80:se llevaron acabo trabajos con vacas y

ovejas, camino que se sigue actualmente . Estos
trabajos consistieron en ir creando nuevos individuos a
partir de clulas cada vez mayores con el fin de
demostrar que por muy desarrollada que este una
clula todava contiene la informacin suficiente para
engendrar un nuevo ser.

El 27 de febrero de 1997 se publica el informe sobre la

primera clonacin de un mamfero (la oveja Dolly) a
partir del ncleo de una clula adulta de otro individuo.
Consisti en modificar genticamente un animal con un
gen humano para posteriormente clonarlo

El primer experimento en cuanto a la clonacin humana

lo realiz Shettles en 1979. En este experimento no se
paso de un estado de desarrollo muy bajo
Posteriormente el cientfico Richard Seed, pretenda
clonar seres humanos. Y segn los medios de
comunicacin lo sigue intentando actualmente.

CLONACION:
clonar significa crear un nuevo ser o varios iguales
por medio de una sola clula somtica de un
ncleo de otro individuo .los cuales son iguales o
casi iguales al original. Es decir al dueo de la
clula somtica es aquel procedimiento que se
realiza para tomar una muestra del material
gentico (genes)de u8n organismo para crear o
procrear
un
nuevo
ser
con
las
misma
caractersticas
mas
no
con
los
mismos
comportamientos .un clon es llamado por la unin
de un ovulo con el espermatozoide.

CLO
N:

Un clon es un copia gentica igual de

otro individuo .el cual no significa que
sea igual en la personalidad.

ENZIMAS DE
RESTRICCI
N

Las
enzimas
de
restriccin,
conocidas
tambin
como endonucleasas,
slo cortan el ADN si
reconocen
en
su
interior
una
secuencia especfica
de nucletidos.

TIPOS DE ENZIMAS DE
RESTRICCIN
Tipo 1: Una sola enzima (con 3 subunidades) tiene actividad de
restriccin (corta) y modificacin (metila). Al reconocer la secuencia
especfica de DNA corta al azar en sitios distintos al sitio de
reconocimiento, ya sea corriente arriba o corriente abajo.
Tipo 2: Solo tienen actividad de restriccin. Otras enzimas llevan a cabo
la metilacin. El corte es efectuado en el sitio de reconocimiento, o bien,
cerca de l, por lo que el corte es resistente y predecible.
Tipo 3: Se utiliza una enzima oligomrica que realiza todas las
actividades enzimticas. Tienen funcin de restriccin y modificacin.
Cortan de 25 a 27 pares de bases lejos del sitio de reconocimiento,
dejando extremos cohesivos

VECTORES DE
ADN
Los vectores de clonacin son molculas que llevan
insertados fragmentos de material gentico que
nosotros queremos introducir en el hospedador ,
molculas

transportadoras

que

transfieren

replican fragmentos de ADN

CARACTERISTICAS DE UN
VECTOR
Ser capaz de replicarse dentro de una clula receptora.
Un vehculo para clonacin necesita ser pequeo.
Poseer marcadores para la seleccin de bacterias.
Poseer una o varias secuencias de restriccin

TIPOS DE VECTORES

PLASMIDOS
Los plsmidos son molculas de DNA
de doble cadena extra cromosmicas
de origen natural que tienen un origen
de replicacin (ori+) y que se replican
autnomamente en las
clulabacterianas. Para poder
utilizarlos en ingeniera gentica, se
han modificado o diseado muchos
plsmidos de manera que contengan
un nmero limitado de sitios de
restriccin y genes de resistencia a
antibiticos especficos.

CARACTERSTICAS:

Tamao pequeo (mejor

manipulacin y aislamiento

Replicacin relajada (permite

obtener el DNA clonado en
grandes cantidades)

PLASMIDOS

BACTERIOFAGO
S
Se utilizan virus y bacterifagos
como
vectores
porque
su
rendimiento
de
infeccin
es
superior al que se obtiene en la
transformacin
con
plsmidos
aunque su manipulacin es ms
compleja. Los vectores virales
admiten y replican de manera
estable insertos mayores que los
plsmidos.
La
infeccin
viral
permite
que
cada
clula
hospedadora
contenga
muchas
copias del gen exgeno y que ste
se exprese abundantemente bajo el
control de los promotores de los
virus que son muy activos.

CICLOS BACTERIOFAGOS

CSMIDOS
son
vectores
hbridos
desarrollados
por
combinacin de plsmidos y del genoma del fago
. Constan de una molcula de DNA de 5kb que
lleva genes de resistencia a antibiticos, el origen
de replicacin de un plsmido bacteriano, los
extremos cos del DNA del fago y sitios nicos de
restriccin para la insercin del DNA a clonar. Los
csmidos recombinantes pueden empaquetarse in
vitroen partculas de fago para infectar las clulas
hospedadoras en las que el DNA se inyecta y
circulariza como fago pero se replica como
plsmido. La seleccin de bacterias se hace, por
eso, por resistencia a antibiticos. Los fragmentos
de DNA clonados pueden ser muy grandes, de
hasta 47kb por lo que son adecuados para la
construccin de genotecas eucariticas.

ARTIFICIALES

YAC

Cromosoma artificial de levadura

Los YAC son cromosomas artificiales
de levadura. Un YAC tiene telmeros
en sus extremos, un origen de
replicacin y un centrmero. Estos
componentes estn unidos a genes
marcadores de seleccin y a un
grupo de enzimas de restriccin
para insertar ADN exgeno.
Estos cromosomas artificiales de
levadura permiten clonar grandes
trozos de ADN, de 100 a 1000 kb.

BAC

Cromosoma artificial bacteriano

Un BAC es un cromosoma artificial
bacteriano, basado en el plsmido de
fertilidad ( factor F ) de bacterias. Es
el ms utilizado.
El factor F es un plsmido que se
replica independientemente y que
transfiere
informacin
gentica
durante la conjugacin bacteriana.
Los BAC son circulares y muy
estables, con lo que no se rompen.
Tienen un tamao de 100 kb y
pueden transportar insertos de entre
100 y 300 kb. Solo permiten una
copia del cromosoma por clula.

TIPOS DE CLONACIN
CLONACION MOLECULAR.
CLONACION CELULAR.
CLONACION
TERAPEUTICA
CLONACION
DE
ORGANISMO DE FORMA
NATURAL
CLONACION DE ESPECIES
EN PELIGRO
DE
EXTINCION.

CLONACIN MOLECULAR
Es un proceso de
aislamiento
de
un
fragmento
de
ADN
especfico
y
la
transferencia
de
este
fragmento en un vector
plasmdico.

CLONACIN CELULAR
Clonar una clula significa
derivar una poblacin celular
a partir de una sola clula.
Ese
es
un
importante
procedimiento
in
Vitro
cuando
se
desea
la
expansin de una sola clula
con ciertas caractersticas.
Una valiosa tcnica de
cultivo de tejido utilizada
para clonar distintos linajes
de clulas incluye el uso de
aros de clonacin (cilindros).

CLONACIN TERAPUTICA
La clonacin teraputica es llevada a
cabo, no para producir otro
organismo, sino para
cosecharclulas madre
embrinicas que debern ser
utilizadas en tratamientos mdicos.
Lasclulas madre embrinicasson
aquellas que pueden encontrarse
dentro de los embriones en
desarrollo. Las mismas puede ser
usadas para producir una gran
cantidad de diferentes clulas, entre
las que se incluyen: tejidos,
msculos, y clulas orgnicas.

CLONACIN DE ORGANISMOS DE
FORMA NATURAL
Consiste en crear
un
nuevo organismo con la
misma
informacin
gentica proveniente de
una clula existente.
es un mtodo
asexual,
donde la fertilizacin no
ocurre.
En trminos
generales
solo
hay un progenitor
involucrado.

CLONACION DE ESPECIES
EN
PELIGRO DE EXTINCION
Consiste en la congelacin de
clulas de animales extintos o
en peligros de extincin para
poder obtener, mas tarde, la
secuencia
de ADN, con la
finalidad de clonar la especie.
Es todo un reto, pero se han
obtenido algunos indicios de que
sea posible, como el 2001
clonaron un gaur, que esta en
peligro de extincin, pero muri
a los dos das.

TECNOLOGA
DEL ADN
RECOMBINANTE
El trmino DNA recombinante
hace referencia a la creacin
de nuevas combinaciones de
segmentos o de molculas de
DNA que no se encuentran
juntas de manera natural.
Aunque el proceso gentico de
la recombinacin produce DNA
recombinante, este trmino se
reserva a las molculas de DNA
producidas por la unin de
segmentos que provienen de
diferentes fuentes biolgicas.

Aqu tenemos un
gen que interesa
insertar en un
plsmido

Una enzima de restriccin a

cortado el gen y el plsmido,
quedando unos bordes
cohesivos y pegajosos
La unin del ADN que
contiene el gen que desea
clonar con el vector de
clonacin se realiza por la
ADN ligasas, unen ambas
partes de ADN , el resultado
es
ADN recombinante ya
que contiene fragmentos de
ADN distintos

Placas de agar con

colonias de bacterias
transformadas
Se presiona con un papel
de nitrocelulosa sobre la
placa de agar
Papel de nitrocelulosa
El tratamiento con lcali
rompe las clulas y expone el
ADN desnaturalizada de agar
ADN unido al papel
Sonda de ADN marcada
radiactivamente
Incubacin del papel con la
sonda radioactiva

Exposicin del papel a la

pelcula de rayos x

Sonda hibridada con las

colonias de inters

ALCALINA
PURIFICACIN DE ADN

AS SE EL ADN RECIN EXTRADO

EN ALCOHOL

REACCION EN CADENA DE
LA POLIMERASA (PCR)

SECUENCIAMIENT
O DE ADN

DEFINICIN:

Es una tcnica en la que se hace un

anlisis
ms
detallado
de
la
estructura del ADN y consiste en un
conjunto de tcnicas y mtodos
bioqumicos
que
nos
permiten
averiguar la secuencia de los
nucletidos (A, C, G, T) en el ADN

ANTECEDENTES:
A

finales de la dcada de 1970 se

desarrollaron dos mtodos que permitan la
secuenciacin de una molcula de ADN de
una manera sencilla y rpida. Al principio, la
idea consista en imitar los clsicos mtodos
de secuenciacin de protenas, donde las
molculas eran fragmentadas y analizada su
composicin en funcin de sus caractersticas
fisicoqumicas, deduciendo as su secuencia a
partir de fragmentos solapantes.

HISTORIA DE LOS MTODOS DE

SECUENCIACIN DE ADN
Histricamente hay dos mtodos de secuenciacin
del ADN:

DEGRADACIN QUMICA:

El mtodo de degradacin qumica fue propuesta

por Maxxam y Gilbert, fue publicado en febrero de
1977

HISTORIA DE LOS MTODOS DE

SECUENCIACIN DE ADN
En

1977 Frederick Sanger (galardonado con el Nobel de

Qumica en 1980, con Walter Gilbert y Paul Berg)
desarrolla y publica las tcnicas de secuenciacin del
ADN, mediante el que pasara a conocerse como
mtodo de los terminadores de cadena o dideoxi.
En 1986 este mtodo es mejorado por el bilogo
molecular estadounidense Leroy Hood con la
automatizacin de las etapas de secuenciacin del ADN
y el anlisis computarizado de los geles obtenidos,
incorporando ordenadores y laser en este proceso

SECUENCIAMIENTO
DE ADN

METODOS DE
SECUENCIACION DE
ADN
Histricamente hay dos
mtodos de
secuenciacin del ADN

Secuenciacin por
terminador
fluorescente

Mtodo de Maxam &

Gilbert o mtodo de
degradacin qumica.
Mtodo de Sanger
Hoy en da es el ms
usado en los
laboratorios

Secuenciacin aleloespecfica por bisulfito

MTODO DE MAXAM
& GILBERT
El
protocolo
de
secuenciacin de MaxamGilbert utiliza reacciones
qumicas en la escisin
en las bases especficas
para generar, a partir de
copias pre-marcadas de
la cadena de ADN para
ser secuenciados.

El mtodo requiere marcaje radiactivo

en uno de los extremos y la
purificacin del fragmento de ADN que
se desea secuenciar. Se marca en los
extremos 5 o 3' de una o ambas
hebras con 32P
Despus la muestra de ADN se divide y
genera rupturas de uno o dos de los
cuatro nucletidos en cada una de las
cuatro reacciones (G, A+G, C, C+T).
Los fragmentos posteriormente se
separan
por
tamao
medianteelectroforesis en gel o auto
radiografa.

LAS REACCIONES QUMICAS QUE SE UTILIZAN

PARA FRAGMENTAR EL ADN SON LAS
SIGUIENTES:

MTODO DE SANGER
Fred Sanger, investigador de la universidad de
Cambridge (Inglaterra) fue uno de los pioneros en la
secuenciacin de protenas, l ideo en el ao de 1977
el mtodo de secuenciacin de ADN llamado
"interrupcin de la cadena" o mtodo didesoxi.

(1918-2013)

FUNDAMEN
TO
El mtodo de Sanger se basa en
la sntesis de una nueva cadena
de DNA que fuera el
complemento de una plantilla
de una sola cadena, de manera
que la identidad de la ltima
letra estuviera determinada.
Adems Sanger incluyo un
nucletido didesoxi modificado.

Para obtener la secuencia de bases nitrogenadas de un segmento de ADN por el

mtodo enzimtico de terminacin de cadena, se necesitan los siguientes
compuestos:

 EL ADN MOLDE O SEGMENTO DE ADN QUE SE DESEA

SECUENCIAR
Para poder secuenciar un segmento de ADN, previamente se necesita tener gran cantidad
de ese fragmento, y por tanto, hay que clonarlo en un vector apropiado.

DNA de cadena simple

Clonacin en bacterifago M13

Debe estar en estado de hlice sencilla

DNA de cadena doble que
se ha desnaturalizado

Tratamiento con calor o

lcali.

Fago M13

M13 es un fago filamentoso que en su forma

replicativa contiene DNA de cadena doble .

Es continuamente excretado de las clulas

bacterianas durante el proceso de infeccin en forma
de virus que contiene DNA de cadena sencilla.
Para obtener DNA monocatenario del fragmento que
se va a secuenciar , simplemente hay que clonarlo en
M13, infectar clulas husped adecuadas y purificar el
DNA de los fagos excretados al medio de crecimiento .

 UNA ENZIMA
QUE REPLIQUE
EL ADN
En el procedimiento original se utilizaba el
fragmento de klenow de la ADN polimerasa
I de E. coli.

Posee una baja velocidad de

polimerizacin
Posee una baja procesividad
(nucletidos que polimeriza antes
de disociarse del ADN molde )
Hoy en da su utilizacin ha sido
desplazada por otras polimerasas
que han superado dichos
inconvenientes

 UN CEBADOR O "PRIMER"
suele ser un oligonucletido corto de alrededor de 20
bases de longitud necesario para que la ADN polimerasa I
comience a aadir nucletidos por el extremo 3' OH. Este
cebador debe poseer una secuencia de bases
complementaria a la del fragmento de ADN que se desea
secuenciar.

Este cebador debe poseer una secuencia de

bases complementarias a la del fragmento de
ADN que se desee secuenciar
Procede de una region muy cercana al punto de
insercin del ADN problema cuya secuencia se
conoce .

 LOS CUATRO NUCLETIDOS

TRIFOSFATO (DATP, DCTP, DGTP Y
DTTP)

NUCLETIDOS DIDESOXI
Son nucletidos modificados que han perdido el grupo hidroxilo de la posicin 3' de la desoxirribosa. Estos
nucletidos pueden incorporarse a la cadena de ADN naciente, pero no es posible que se una a ellos ningn
otro nucletido por el extremo 3'.

Existen algunas variaciones tcnicas del mtodo de secuenciacin de

terminacin de la cadena.
En un mtodo, los fragmentos de ADN son marcados con nucletidos marcados con fsforo radiactivo.
Como alternativa se puede utilizar un cebador marcado en el extremo 5' mediante un colorante
fluorescente.

SEPARACIN DE LOS
FRAGMENTOS
(SANGER)

Todos los mtodos actuales de secuenciacin

requieren que la separacin de los fragmentos de
DNA detecten diferencias en longitud de una base.

Esto se logra por una electroforesis ya sea

en geles de poliacrilamida o en capilares con
polmeros lquidos.

SEPARACIN DE LOS FRAGMENTOS

(SANGER)

Una vez terminada la electroforesis, el

gel se pone en contacto con una
pelcula fotogrfica de autorradiografa.
ADN-C :

5'
AAATCAATTCTGTGAACGATAATCCAGTCATTGATGTTGCCAG
AGACAAAGCT 3'
3'
TTTAGTTAAGACACTTGCTATTAGGTCAGTAACTACAACGCTC
TCTGTTTCGA 5'

ADN-M

SECUENCIACIN POR TERMINADOR

marcan los cuatro
FLUORESCENTE Se
Didesoxinucletidos con
La secuenciacin se
puede llevar a cabo en
una sola reaccin.

Los fragmentos
de ADN obtenidos
se separan por
electroforesis
capilar
stos terminan la cadena
dando fluorescencias a
diferentes longitudes de
onda.

Didesoxinucletidos con
colorantes fluorescente
no interfiere en la
reaccin de la polimerasa

ddTtp
ddGtp
ddCtp
ddAtp
ddNTP terminal

SECUENCIACIN ALELO-ESPECFICA
La amplificacin de
POR BISULFITO
Utilizada para
el mapeo de
metilacin en los
sitios CPG.

Metilacin del ADN

fue la primera
marca Epigentica
descubierta y sigue
siendo el ms
estudiada.

la regin que
queremos mapear x
PCR y se secuencia
de forma normal

FUNCION:

Desamina las citosinas

del ADN
convirtindolas en
uracilo
Incapaz de actuar en
las citosinas q se
encuentren metiladas

Aplica mtodos de
secuenciacin de
rutina de bisulfito
tratados con ADN
genmico para
determinar el estado
de metilacin de los
Dinucletidos CpG.

SECUENCIACIN ALELO-ESPECFICA
POR BISULFITO- LIMITACIONES
CONVERSION
INCOMPLETA

Interpretacin incorrecta :
Las Citosinas no metiladas no
convertidas en uracilo como
citosinas metiladas, dando
lugar a falsos positivos para la
metilacin.

LIMITACIONES

DEGRADACION DEL ADN

Largos tiempos de incubacin
T elevada
Altas [] de NaHSo3
pequeas roturas al azar a lo largo
de la cadena de ADN y dar errores
durante la amplificacin por PCR

DESULFONACION INCOMPLETA
DE LOS RESIDUOS DE
PIRIMIDINA

Una inadecuada alcalinizacin de la

solucin donde afecta negativamente las
polimerasas de ADN , las cuales sern
incapaces de replicar la cadena molde.

Estrategias y
aplicaciones de la
secuenciacin de
cidos nucleicos

El proyecto del genoma

humano

EL PROYECTO GENOMA HUMANO

(PGH)

Fue un proyecto de investigacin cientfica que tuvo el objetivo fundamental de determinar la secuencia
de pares de bases que componen el ADN

Se realizo por el Departamento de Energa y los Institutos Nacionales de la Salud de los Estados Unidos,
bajo la direccin del doctor Francis Collins, quien lideraba el grupo de investigacin pblico , conformado
por mltiples cientficos de diferentes pases, con un plazo de realizacin de 15 aos.

Este proyecto del genoma humano inicio el ao 1990 y finaliz en el 2001, cuatro aos antes de la fecha
prevista(2005) .Gracias a los avances en el campo de la genmica, as como los avances en la tecnologa
computacional.(la mayor parte de la secuencia se obtuvo con tecnologa ABI PRISM 3700) .

El genoma humano es la secuencia de ADN

cromosomas (22 pares de autosomas y 1 par

El genoma humano est compuesto por aproximadamente entre 22500 y 25000 genes distintos. Cada uno de
estos genes contiene codificada la informacin necesaria para la sntesis de una o varias protenas. se logro
secuenciar un total aproximado de 3000 millones de pares de bases de ADN (3200 Mb) .

y Est dividido en fragmentos que conforman los 23 pares de

de cromosomas sexuales).

ESTRATEGIAS PARA LA SECUENCIACIN DE FRAGMENTOS GRANDES

DE ADN
Hay dos estrategias generales para secuenciar fragmentos grandes de
ADN.

chromosome walking

Shotgun Sequencing

CHROMOSOME WALKING

El chromosome walking es un mtodo de clonacin posicional utilizado para aislar

y clonar un gen en particular con una biblioteca de genes .
A partir de experimentos de mapeo gentico se sabe que un gen particular es un
gen previamente clonado, y es posible mediante el aislamiento de clones genmicos
repetidamente adyacentes de la biblioteca.
El proceso se conoce como paseo cromosmico y se utiliza para moverse a lo largo
de un cromosoma de una ubicacin conocida y para clonar los clones genmicos
superpuestos que representan progresivamente partes de un cromosoma particular
Un pequeo segmento de ADN a partir de un extremo del clon genmico se usa como
una sonda para aislar clones que contienen esta secuencia y las secuencias
adyacentes que codifican la siguiente porcin del genoma.
La secuencia final de la segunda clon se utiliza para aislar un tercer clon y as
sucesivamente hasta que se aisl una serie de clones superpuestos.
Es necesario el uso de sondas de ADN cuyas secuencias son de una sola copia, de lo
contrario si la sonda utilizada es una secuencia repetida.

CONSISTE EN LO SIGUIENTE:
1.

La fragmentacin parcial del ADN para su

insercin en un vector de clonacin.

2.

La obtencin de un banco de clonas

fragmentos que contienen segmentos que
traslapan.

de
se

La secuenciacin de una clona y la

identificacin de una segunda que posea la
continuacin del segmento que se est
secuenciando. Este proceso se repite hasta
que se completa la secuencia de la molcula
original de ADN.
Esta estrategia se utiliz originalmente en el
proyecto de secuenciacin del genoma
humano.
3.

http://gxs.home.texas.net/work_samples/flash_samples
/R1450AW.html

SHOTGUN SEQUENCING

La segunda estrategia general para la secuenciacin de fragmentos

grandes de ADN, se llama secuenciacin tipo shotgun(secuenciacin
automtica ).
La gran diferencia entre esta estrategia y la anterior es que en el
shotgun se hace a partir de fragmentos que han sido cortados al azar.
Despus, se utiliza un programa de cmputo para encontrar las regiones
que se traslapan entre las secuencias individuales. De esta manera se va
ensamblando la secuencia del fragmento original.
Las secuencias ms largas se subdividen en fragmentos ms pequeos que
pueden ser secuenciados por separado, y posteriormente se reensamblados para dar la secuencia global.

Genes clonados
Mltiples genes son cortes en
diferentes tamaos al azar .
Fragmentos de secuenciacin
desordenados
Montaje automtico por la
computadora

Resultado por superposicin

Superposicin del segmento para
construir la secuencia del genoma
humano

SHOTGUN SEQUENCING

SHOTGUN SEQUENCING
La Ventaja :

La Desventaja

es rpida
requiere la sntesis de pocos
iniciadores
tiene una eficiencia
comprobada.

esta estrategia requiere la

redundancia de las secuencias para
asegurar la obtencin de una muestra
completa del ADN original.
se requiere mucha tecnologa
computacional para ensamblar la
secuencia original
quedan gaps (regiones del
fragmento original que no se
secuenciaron).

SECUENCIA DE ALTO RENDIMIENTO CON

TECNOLOGAS