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Facultad de Ciencias Químicas

Curso de microbiología Diagnóstica

Enero 2010

Coprocultivo

Diagnóstico de laboratorio de Infecciones bacterianas gastrointestinales

M.A. MA OLGA GONZALEZ RANGEL

Chihuahua, Chih., enero 2010

Coprocultivo

Coprocultivo

Coprocultivo

El diagnóstico de las diarreas agudas bacterianas se realiza mediante la prescripción de coprocultivos típicos u orientados, realizados después del interrogatorio

Coprocultivo El diagnóstico de las diarreas agudas bacterianas se realiza mediante la prescripción de coprocultivos típicos

Coprocultivo

Diagnóstico de orientación:

• Examen macroscópico y microscópico de las heces. Patógenos:

Salmonella, Shigella, Campylobacter y Yersinia E coli y Virus. Diagnósticos epidemiológicos clínicos Para Vibrio cholerae, Clostridium difficile o E coli enterohemorrágica

Coprocultivo Diagnóstico de orientación: • Examen macroscópico y microscópico de las heces. Patógenos: Salmonella, Shigella, Campylobacter

Coprocultivo

Diarrea aguda según la OMS:

Emisión de al menos tres heces líquidas o blandas al día con menos de 14 días de antelación.

Coprocultivo Diarrea aguda según la OMS: Emisión de al menos tres heces líquidas o blandas al

Coprocultivo

De importancia para el microbiólogo:

Información de los signos clínicos como:

Dolores abdominales, fiebre, aspecto de las heces, entre otros.

Coprocultivo De importancia para el microbiólogo: Información de los signos clínicos como: Dolores abdominales, fiebre, aspecto

Coprocultivo

Obtención de la muestra:

Las heces recientemente recogidas se llevarán lo más rápidamente posible al laboratorio. Si el análisis es diferido, la muestra se puede conservar durante 12 a 24 horas a 4 C para evitar proliferación bacteriana.

Coprocultivo Obtención de la muestra: Las heces recientemente recogidas se llevarán lo más rápidamente posible al

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Obtención y transporte de muestras fecales para el diagnóstico de laboratorio

Cuándo se toma la muestra Cuando el paciente tiene diarrea, lo antes posible luego del comienzo de la enfermedad (preferiblemente dentro de los cuatro primeros días) y antes de comenzar el tratamiento con antimicrobianos.

Cuánto se debe obtener Un hisopo rectal o aplicador de muestra fresca en un medio de transporte.

Medio de transporte Cary-Blair u otro medio de transporte conveniente (NO debe usarse glicerol salino de tampón para el transporte de muestras de V. cholerae).

Almacenamiento después de la colección Refrigerar a 4°C si los especímenes se recibirán en el laboratorio antes de las 48 horas o congelar a -70°C. Las muestras fecales de pacientes con sospecha de tener cólera pueden ser transportadas a temperatura ambiente y mantenidas por largo tiempo si es necesario; sin embargo, se prefiere la refrigeración.

Transporte Tubos sellados o recipientes a prueba de pérdidas; colocar en un recipiente hermético para proteger del hielo o hielo seco. Remitir en una caja aislada con paquetes de congelación, hielo o hielo seco, para entrega al día siguiente.

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Examen macroscópico:

Aspecto de las heces:

líquidas, acuosas, mucosas, mucoso – sangrientas, hemorrágicas, blandas. Orientan sobre patógenos responsables como: enteroinvasivo (Salmonella spp., Shigella spp) o enterotoxigénico (Vibrio cholerae, E coli enterotoxigénico)

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Examen microscópico:

En fresco: Si las heces son líquidas, un examen directo entre porta y cubre permitirá poner de manifiesto la presencia de leucocitos, hematíes o la movilidad de bacterias como Campylobacter spp o Vibrio spp.

La presencia de leucocitos se relaciona a una infección por gérmenes invasivos (Salmonella, Shigella, Campylobacter) o por no invasivos productores de toxinas que inducen a lesiones mucosas cólicas (C difficile toxigénico)

Coprocultivo Examen microscópico: • En fresco: Si las heces son líquidas, un examen directo entre porta

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Cultivo:

La flora intestinal es una flora comensal compleja, por lo que se recomienda utilizar medios selectivos para aislar específicamente los enteropatógenas e inhibir la flora asociada.

La recomendación es:

• Un medio lactosado poco selectivo. • Un medio más selectivo, y

Un medio selectivo de enriquecimiento, elegido en función de la bacteria a investigar.

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Medios selectivos de aislamiento para Salmonellas: se recomienda los que contienen sustratos por los caracteres de lactosa y reducción de sulfatos: Agar SS, XLD, DCL (desoxicolato – citrato – lactosa), Hektoen.

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Medios selectivos de

enriquecimiento: Se utiliza el medio de Müller-Kaufman, Caldo de selenito de Leifson, Caldo de Tetratoniato.

Después de 24 horas de incubación, se resiembra en medios de aislamiento selectivos como el Sulfito de Bismuto.

Se utilizan sistemáticamente para aumentar la sensibilidad de detección de Salmonellas en las heces o en bacteriología alimentaria.

Coprocultivo Medios selectivos de enriquecimiento : Se utiliza el medio de Müller-Kaufman, Caldo de selenito de

Coprocultivo

Agar bismuto sulfito (ABS)

El agar bismuto sulfito (ABS), el cual es altamente selectivo, es el medio de preferencia para el aislamiento de S typhi. No obstante, el Agar Bismuto Sulfito no se debe utilizar para el aislamiento de S typhi si ha sido almacenado por más de 24-36

horas. Se ha notificado que ABS inhibe los otros serotipos de Salmonella no S typhi, a no ser que sea refrigerado a 4°C por lo menos 24 horas antes de ser utilizado. Cuando se cultivan muestras de fecales de portadores sospechosos de

tifoidea, el uso de una placa vertida de ABS puede favorecer el aislamiento.

Coprocultivo • Agar bismuto sulfito (ABS ) El agar bismuto sulfito (ABS), el cual es altamente

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Identificación:

• Pruebas bioquímicas:

galerías API 20E o 10S y medio Kigler. Pruebas como urea, movilidad, citrato, sustratos cromogénicos C8 estereasa, entre otras.

Coprocultivo Identificación: • Pruebas bioquímicas: galerías API 20E o 10S y medio Kigler. Pruebas como urea,

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Identificación:

• Pruebas bioquímicas:

sembrar en TSI y LIA además de MIO.

En general Salmonella es negativa a las pruebas de,ureasa, indol, lactosa y sacarosa y positiva a las pruebas de descarboxilación de lisina y ornitina, así como generalmente producen H2S, pero existen variantes atípicas con reacciones positivas a lactosa o no descarboxilación de lisina.

Coprocultivo Identificación: • Pruebas bioquímicas: sembrar en TSI y LIA además de MIO. En general Salmonella

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Identificación:

Identificación antigénica para determinar el serotipo según el esquema de Kauffman- White.

Coprocultivo Identificación: Identificación antigénica para determinar el serotipo según el esquema de Kauffman- White.

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Interpretación del coprocultivo estándar:

En el caso de diarrea aguda, el aislamiento de Salmonellas, Shigella, Campylobacter o Yersinia tiene que ser siempre considerado como significativo.

Coprocultivo Interpretación del coprocultivo estándar : En el caso de diarrea aguda, el aislamiento de Salmonellas,

Coprocultivo

Procedimientos básicos en la toma de muestras biológicas para diagnóstico.

Materia Fecal: La muestra de materia fecal (diarreica, pastosa o formada) debe ser reciente (< de 24 hrs) Las heces obtenidas del suelo, excusado o pañal no son aceptadas por la contaminación ambiental a que fueron expuestas

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Procedimientos básicos en la toma de muestras biológicas para diagnóstico.

Hisopo Rectal: Emplear este tipo de muestra solamente en casos sospechosos de etiología bacteriana.

Tomar la muestra introduciendo la punta de un hisopo de algodón, previamente humedecido en solución salina estéril o medio de transporte, en el recto y rotarlo ligeramente. La presencia de un ligero color café en el hisopo indica que la muestra ha sido bien tomada. Introducir el hisopo con la muestra hasta el fondo de un tubo de tapón de rosca con medio de transporte Cary-Blair.

Sistema de Identificación Microbiana BBL Crystal 

Sistema de Identificación Microbiana BBL Crystal

Sistema de Identificación Microbiana BBL Crystal 

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Durante un brote, las muestras de heces o de hisopados rectales deben obtenerse de entre 10 y 20 personas que cumplan los siguientes criterios:

• Actualmente tienen diarrea acuosa (cólera) o diarrea sanguinolenta (disentería)

• La enfermedad se inició menos de 4 días antes del muestreo, y

• No han recibido tratamiento antimicrobiano para la enfermedad diarreica.

Las muestras de fecales se deben obtener en los primeros estadios de cualquier enfermedad entérica, cuando los agentes patógenos están por lo regular presentes en las heces en su mayor número, y antes de que el tratamiento antibiótico se haya iniciado. Una excepción a esta regla es el caso de las heces obtenidas de pacientes con enfermedad febril: en el caso de fiebre tifoidea, el agente etiológico, Salmonella ser typhi, puede estar presente en las heces, en la máxima cantidad, en la segunda y tercera semanas de la enfermedad.

Coprocultivo Durante un brote , las muestras de heces o de hisopados rectales deben obtenerse de

Coprocultivo

Obtención de muestra de heces

Las muestras de heces deben colectarse en recipientes limpios, sin desinfectantes ni

residuos de detergentes, y con las tapas bien cerradas y a prueba de derrames. Las

muestras no deben sacarse de pañales, porque pueden contener residuos de

desinfectantes u otros contaminantes. Las muestras fecales no preservadas deben,

en lo posible, refrigerarse, y procesarse como máximo 2 horas después de haberlas

obtenido. Las muestras que no se pueden cultivar en un plazo de 2 horas después

de haberse obtenido, se deben colocar en medio de transporte y refrigerar

inmediatamente.

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Obtención y transporte de muestras fecales para el diagnóstico de laboratorio

Cuándo se toma la muestra Cuando el paciente tiene diarrea, lo antes posible luego del comienzo de la enfermedad (preferiblemente dentro de los cuatro primeros días) y antes de comenzar el tratamiento con antimicrobianos.

Cuánto se debe obtener Un hisopo rectal o aplicador de muestra fresca en un medio de transporte.

Medio de transporte Cary-Blair u otro medio de transporte conveniente (NO debe usarse glicerol salino de tampón para el transporte de muestras de V. cholerae).

Almacenamiento después de la colección Refrigerar a 4°C si los especímenes se recibirán en el laboratorio antes de las 48 horas o congelar a -70°C. Las muestras fecales de pacientes con sospecha de tener cólera pueden ser transportadas a temperatura ambiente y mantenidas por largo tiempo si es necesario; sin embargo, se prefiere la refrigeración.

Transporte Tubos sellados o recipientes a prueba de pérdidas; colocar en un recipiente hermético para proteger del hielo o hielo seco. Remitir en una caja aislada con paquetes de congelación, hielo o hielo seco, para entrega al día siguiente.

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Medios de transporte para muestras fecales

Información relativa a los medios apropiados para el transporte de muestras fecales que se sospecha contienen Shigella, Vibrio cholerae o Salmonella (incluido el serotipo typhi). Una vez que las muestras de un brote de enfermedad diarreica llegan al laboratorio, los laboratoristas deben seguir los

procedimientos para el aislamiento de Shigella o V. cholerae, según si los informes recibidos indican que el brote parece ser disentería o una enfermedad parecida al cólera. Las personas de quienes se sospecha que pueden tener tifoidea presentarán por lo regular fiebre sin diarrea, por lo que los laboratorios no reciben normalmente un gran número de muestras fecales durante los brotes de tifoidea. Sin embargo, hay veces en que se pueden enviar muestras fecales a un laboratorio para el diagnóstico de infección por S typhi

Coprocultivo

Colocación de las heces en el medio de transporte

Coprocultivo • Colocación de las heces en el medio de transporte Si es posible, enfríe el

Si es posible, enfríe el medio de transporte durante 1 a 2 horas en un refrigerador o caja nevera antes de utilizarlo. Se puede obtener una pequeña cantidad de heces insertando en ellas un hisopo de punta de algodón estéril o de poliéster y rotándolo. Si están presentes mucus o detritus del epitelio intestinal, también debe obtenerse una muestra en el hisopo. Para seguir el muestreo de las heces en el hisopo:

a) Inserte inmediatamente el hisopo que contiene material fecal dentro del medio de transporte.

b) Empuje el hisopo completamente, hasta el fondo del tubo del medio de transporte.

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  • c) Rompa la parte superior del palillo con los dedos y deséchelo.

  • d) Ponga nuevamente la tapa de rosca en el tubo del medio de transporte y ciérrela bien.

  • e) Coloque el tubo en el refrigerador o en la caja nevera.

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Obtención de hisopados rectales

Algunas veces se obtienen hisopados rectales en lugar de muestras de heces. Los hisopados rectales pueden obtenerse como sigue:

  • a) Humedezca el hisopo en medio de transporte estéril.

  • b) Inserte el hisopo por el esfínter rectal 2 a 3 cm (1 a 1,5 pulgadas) y rótelo.

  • c) Saque el hisopo del esfínter rectal y examínelo para estar seguro de que hay material fecal visible en el hisopo. (Si no, repita el procedimiento con el mismo hisopo.)

  • d) Inserte inmediatamente el hisopo en el medio de transporte en frío (como se describe en la sección anterior).

  • e) Ponga el tubo en un refrigerador o caja nevera.

El número de hisopos necesarios dependerá del número de placas a inocular. En general, si las muestras se van a examinar para detectar la presencia de más de un agente patógeno, será necesario obtener al menos dos hisopos con heces o rectales por paciente, y ambos hisopos deben ser insertados dentro del mismo tubo de medio de transporte. Una vez que el hisopo está colocado en el medio, debe permanecer en el tubo hasta que sea procesado en el laboratorio.

Aislamiento y Cultivo de Salmonellas

Al igual que el resto de Enterobacteriaceae, S typhi es un bacilo (bastón) gramnegativo

Aislamiento y Cultivo de Salmonellas  Al igual que el resto de Enterobacteriaceae , S t

Aislamiento y Cultivo de Salmonellas

La bacteria Salmonella serotipo typhi (S. typhi), agente etiológico de la fiebre tifoidea, causa alrededor de 16,6 millones de casos y 600.000 muertes al año en todo el mundo. Los serotipos “paratifoídicos” de Salmonella causan un síndrome similar a la fiebre tifoidea. Los aislamientos de los serotipos paratifoídicos (por ejemplo, S. paratyphi A, S. paratyphi B y S. paratyphi C) son mucho menos frecuentes que los de S. typhi. En raras ocasiones, otros serotipos de Salmonella, como S. enteritidis, pueden también causar “fiebre entérica”. Como otros patógenos entéricos, las infecciones por S. typhi se transmiten por los alimentos y el agua contaminados con heces de personas con infección aguda, excretores persistentes o portadores crónicos asintomáticos.

Aislamiento y Cultivo de Salmonellas

Las Salmonellas se pueden aislar en un Agar Sangre, pero por su importancia en muestras clínicas se han elaborado diversos medios diferenciales, selectivos y altamente selectivos.

Aislamiento y Cultivo de Salmonellas Las Salmonellas se pueden aislar en un Agar Sangre, pero por

Aislamiento y Cultivo de Salmonellas

NORMA OFICIAL MEXICANA

NOM-114-SSA1-1994,

BIENES Y SERVICIOS. MÉTODO PARA LA DETERMINACIÓN DE SALMONELLA EN

ALIMENTOS .

Establece

6.1.2 Caldo de enriquecimiento

Aislamiento y Cultivo de Salmonellas NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-114-SSA1-1994, BIENES Y SERVICIOS. MÉTODO PARA LA DETERMINACIÓN

Aislamiento y Cultivo de Salmonellas

6.1.2.1 Caldo selenito-cistina Fórmula • Triptona o polipeptona 5,00 g Lactosa 4,00 g Fosfato disódico 10,00
6.1.2.1 Caldo selenito-cistina
Fórmula
• Triptona o polipeptona 5,00 g
Lactosa 4,00 g
Fosfato disódico 10,00 g
Selenito ácido de sodio 4,00 g
L-cistina 0,01 g
Agua destilada 1,00 l
pH final: 7,0 ; 0,2 a 25C
Preparación
Disolver los ingredientes en un litro de agua
destilada estéril y distribuir en volúmenes de
10 y 225 ml en recipientes estériles, según
se requiera.
El caldo así preparado es transparente. De
preferencia usarlo el mismo día de su
preparación.
Si se desea conservar el medio por varios
días, puede exponerse al calor en autoclave
por 5 min a 110C, tomando entonces un
color salmón.

Aislamiento y Cultivo de Salmonellas

Caldo de selenito (SEL)

El caldo de selenito (SEL) se utiliza frecuentemente como un caldo de

enriquecimiento para Salmonella, incluida S typhi.

Para cualquier laboratorio puede ser ventajoso utilizar el SEL, porque también puede utilizarse como enriquecimiento para Shigella. El SEL solamente debe ser incubado durante 14–16horas a 35°C–37°C. Después de la incubación, el caldo de selenito debe ser estriado en un medio de agar selectivo (por ejemplo, EH o DXL).

Control de calidad: Después de enriquecer toda la noche en SEL, Salmonella spp.

produce típicamente un crecimiento de bueno a excelente cuando es estriada en agar MacConkey.

Aislamiento y Cultivo de Salmonellas • Caldo de selenito (SEL) El caldo de selenito (SEL) se

Aislamiento y Cultivo de Salmonellas

6.1.2.2 Caldo tetrationato Fórmula Ingredientes Cantidades Unidades • Proteosa peptona o triptona 5,0 g • Sales
6.1.2.2 Caldo tetrationato
Fórmula
Ingredientes Cantidades Unidades
• Proteosa peptona o triptona 5,0 g
Sales biliares 1,0 g
Carbonato de calcio 10,0 g
Tiosulfato de sodio pentahidratado 30,0 g
Agua destilada 1,0 l
pH final: 7,0 ; 0,1
Preparación
Disolver los ingredientes en un litro de agua
destilada estéril.
Distribuir, agitando constantemente, en
porciones de 10 y 225 ml, en recipientes
estériles. Guardar en refrigeración.
Antes de usar el medio, agregar 2 ml de
una solución yodo-yoduro y 1 ml de solución
de verde brillante al 0,1% por cada 100 ml
de caldo. El medio una vez adicionado de
yodo no debe calentarse y debe usarse el
mismo día de su preparación.

Aislamiento y Cultivo de Salmonellas

8.2 Aislamiento de Salmonella •

8.2.1 Cerrar firmemente el tapón de rosca de los matraces con los cultivos de preenriquecimiento y agitar suavemente, transferir respectivamente 1 ml de la mezcla a un tubo que contenga 10 ml de caldo tetrationato y a otro con 10 ml de caldo selenito cistina. Como alternativa, en sustitución del caldo tetrationato puede emplearse el medio Vassiliadis-Rappaport.

8.2.2 Incubar de 18 a 24 h a 35 C o, para alimentos fuertemente contaminados a 42C por el mismo periodo. Estriar los productos que fueron directamente enriquecidos en medios selectivos.

8.2.3 Mezclar el tubo con caldo selenito cistina y estriar en agar xilosa lisina desoxicolato (XLD), agar verde brillante (VB) y una tercera caja con cualquiera de los medios selectivos adicionales (agar entérico Hektoen, agar Sulfito de Bismuto o Agar SS).

Efectuar el mismo procedimiento para el caldo tetrationato.

Incubar las placas 24 hrs; 2 h a 35C.

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8.2.4 Examinar las placas para investigar la presencia de colonias típicas de Salmonella, de acuerdo con las siguientes características:

Agar XLD: colonias rosas o rojas que pueden ser transparentes con o sin centro negro. En algunos casos las colonias pueden aparecer completamente negras.

Aislamiento y Cultivo de Salmonellas 8.2.4 Examinar las placas para investigar la presencia de colonias típicas

Aislamiento y Cultivo de Salmonellas

Agar VB: colonias rojas o rosas que pueden ser transparentes rodeadas por medio enrojecido; las bacterias fermentadoras de la lactosa dan colonias amarillas.

Aislamiento y Cultivo de Salmonellas  Agar VB : colonias rojas o rosas que pueden ser

Aislamiento y Cultivo de Salmonellas

Agar entérico Hektoen: colonias verdes o azulverdes con o sin centro negro. En algunos casos las colonias pueden aparecer completamente negras.

Aislamiento y Cultivo de Salmonellas  Agar entérico Hektoen : colonias verdes o azulverdes con o

Aislamiento y Cultivo de Salmonellas

Agar Sulfito de Bismuto: las colonias típicas de Salmonella pueden ser cafés, grises o negras; con o sin brillo metálico. Generalmente el medio circundante (halo) es café, tornándose posteriormente negro. Algunas cepas producen colonias verdes sin la formación del halo oscuro. Si las placas no muestran colonias típicas o no se observa crecimiento, incubar 24 h adicionales.

Aislamiento y Cultivo de Salmonellas  Agar Sulfito de Bismuto : las colonias típicas de Salmonella

Aislamiento y Cultivo de Salmonellas

Agar SS: colonias translúcidas, ocasionalmente opacas. Algunas colonias dan centro negro. Las colonias fermentadoras de la lactosa son rojas.

Aislamiento y Cultivo de Salmonellas  Agar SS : colonias translúcidas, ocasionalmente opacas. Algunas colonias dan

Aislamiento y Cultivo de Salmonellas

8.3 Identificación bioquímica

Aislamiento y Cultivo de Salmonellas  8.3 Identificación bioquímica

Aislamiento y Cultivo de Salmonellas

8.4 Identificación serológica

8.4.1 Ensayo de los antígenos somáticos de Salmonella (Antisuero polivalente

O)

Aislamiento y Cultivo de Salmonellas 8.4 Identificación serológica • 8.4.1 Ensayo de los antígenos somáticos de

Aislamiento y Cultivo de Salmonellas

Por lo tanto, si deseamos hacer un buen diagnóstico bacteriológico para el aislamiento e identificación de bacterias entero - patógenas debemos utilizar los medios de enriquecimiento como alternativas que nos ofrecen resultados efectivos.

Aislamiento y Cultivo de Salmonellas Por lo tanto, si deseamos hacer un buen diagnóstico bacteriológico para

Aislamiento y Cultivo de Salmonellas

Algunos estudios de investigación describen un incremento en la recuperación de Salmonellas hasta de un 700% con el uso de medios de enriquecimiento

Aislamiento y Cultivo de Shigellas

• El sello distintivo de la infección por Shigella es la diarrea con sangre, frecuentemente conocida como “disentería”. Sin embargo, en casi la mitad de los casos, las infecciones por Shigella causan diarrea aguda no sanguinolenta que no se puede distinguir clínicamente de la diarrea causada por otros agentes patógenos entéricos

Aislamiento y Cultivo de Vibrio

La mayoría de los aislamientos de Vibrio cholerae obtenidos durante brotes de cólera serán de los serogrupos toxigénicos O1 u

O139.

I

I
Antibiograma
Antibiograma

Coprocultivo

Coprocultivo

Coprocultivo

Gracias

Coprocultivo Gracias