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Facultad de Ciencias

Qumicas
Curso de microbiologa
Diagnstica
Enero 2010

Coprocultivo
Diagnstico de laboratorio de
Infecciones bacterianas
gastrointestinales
M.A. MA OLGA GONZALEZ RANGEL
Chihuahua, Chih., enero 2010

Coprocultivo

Coprocultivo
El diagnstico de las
diarreas agudas
bacterianas se realiza
mediante la
prescripcin de
coprocultivos tpicos
u orientados,
realizados despus
del interrogatorio

Coprocultivo
Diagnstico de orientacin:
Examen macroscpico y
microscpico de las
heces.
Patgenos:
Salmonella, Shigella,
Campylobacter y Yersinia
E coli y Virus.
Diagnsticos
epidemiolgicos clnicos
Para Vibrio cholerae,
Clostridium difficile o E
coli enterohemorrgica

Coprocultivo
Diarrea aguda segn la
OMS:
Emisin de al menos
tres heces lquidas o
blandas al da con
menos de 14 das de
antelacin.

Coprocultivo
De importancia para el
microbilogo:
Informacin de los
signos clnicos como:
Dolores abdominales,
fiebre, aspecto de las
heces, entre otros.

Coprocultivo
Obtencin de la muestra:
Las heces recientemente
recogidas se llevarn lo
ms rpidamente posible
al laboratorio. Si el
anlisis es diferido, la
muestra se puede
conservar durante 12 a
24 horas a 4 C para
evitar proliferacin
bacteriana.

Coprocultivo
Obtencin y transporte de muestras fecales para el diagnstico de laboratorio
Cundo se toma la muestra Cuando el paciente tiene diarrea, lo antes posible
luego del comienzo de la enfermedad (preferiblemente dentro de los cuatro
primeros das) y antes de comenzar el tratamiento con antimicrobianos.
Cunto se debe obtener Un hisopo rectal o aplicador de muestra fresca en un
medio de transporte.
Medio de transporte Cary-Blair u otro medio de transporte conveniente (NO
debe usarse glicerol salino de tampn para el transporte de muestras de V.
cholerae).
Almacenamiento despus de la coleccin Refrigerar a 4C si los
especmenes se recibirn en el laboratorio antes de las 48 horas o congelar a
-70C. Las muestras fecales de pacientes con sospecha de tener clera pueden
ser transportadas a temperatura ambiente y mantenidas por largo tiempo si es
necesario; sin embargo, se prefiere la refrigeracin.
Transporte Tubos sellados o recipientes a prueba de prdidas; colocar en un
recipiente hermtico para proteger del hielo o hielo seco. Remitir en una caja
aislada con paquetes de congelacin, hielo o hielo seco, para entrega al da
siguiente.

Coprocultivo
Examen macroscpico:
Aspecto de las heces:
lquidas, acuosas,
mucosas, mucoso
sangrientas,
hemorrgicas, blandas.
Orientan sobre
patgenos responsables
como: enteroinvasivo
(Salmonella spp.,
Shigella spp) o
enterotoxignico (Vibrio
cholerae, E coli
enterotoxignico)

Coprocultivo
Examen microscpico:
En fresco: Si las heces son
lquidas, un examen directo entre
porta y cubre permitir poner de
manifiesto la presencia de
leucocitos, hemates o la
movilidad de bacterias como
Campylobacter spp o Vibrio spp.

La presencia de leucocitos se
relaciona a una infeccin por
grmenes invasivos (Salmonella,
Shigella, Campylobacter) o por no
invasivos productores de toxinas
que inducen a lesiones mucosas
clicas (C difficile toxignico)

Coprocultivo
Cultivo:
La flora intestinal es una flora comensal compleja,
por lo que se recomienda utilizar medios
selectivos para aislar especficamente los
enteropatgenas e inhibir la flora asociada.
La recomendacin es:
Un medio lactosado poco selectivo.
Un medio ms selectivo, y
Un medio selectivo de enriquecimiento,
elegido en funcin de la bacteria a investigar.

Coprocultivo
Medios selectivos de
aislamiento para
Salmonellas: se
recomienda los que
contienen sustratos
por los caracteres de
lactosa y reduccin
de sulfatos: Agar SS,
XLD, DCL
(desoxicolato citrato
lactosa), Hektoen.

Coprocultivo
Medios selectivos de
enriquecimiento: Se utiliza el
medio de Mller-Kaufman,
Caldo de selenito de Leifson,
Caldo de Tetratoniato.
Despus de 24 horas de
incubacin, se resiembra en
medios de aislamiento
selectivos como el Sulfito de
Bismuto.
Se utilizan sistemticamente
para aumentar la
sensibilidad de deteccin de
Salmonellas en las heces o
en bacteriologa alimentaria.

Coprocultivo

Agar bismuto sulfito (ABS)

El agar bismuto sulfito (ABS), el cual es


altamente selectivo, es el medio de
preferencia para el aislamiento de S
typhi. No obstante, el Agar Bismuto
Sulfito no se debe utilizar para el
aislamiento de S typhi si ha sido
almacenado por ms de 24-36
horas. Se ha notificado que ABS
inhibe los otros serotipos de
Salmonella no S typhi, a no ser que
sea refrigerado a 4C por lo menos 24
horas antes de ser utilizado. Cuando
se cultivan muestras de fecales de
portadores sospechosos de
tifoidea, el uso de una placa vertida de
ABS puede favorecer el aislamiento.

Coprocultivo
Identificacin:
Pruebas bioqumicas:
galeras API 20E o
10S y medio Kigler.
Pruebas como urea,
movilidad, citrato,
sustratos
cromognicos C8
estereasa, entre
otras.

Coprocultivo
Identificacin:
Pruebas bioqumicas:
sembrar en TSI y LIA adems de
MIO.
En general Salmonella es
negativa a las pruebas
de,ureasa, indol, lactosa y
sacarosa y positiva a las
pruebas de descarboxilacin
de lisina y ornitina, as como
generalmente producen H2S,
pero existen variantes atpicas
con reacciones positivas a
lactosa o no descarboxilacin
de lisina.

Coprocultivo
Identificacin:
Identificacin antignica
para determinar el
serotipo segn el
esquema de
Kauffman- White.

Coprocultivo
Interpretacin del
coprocultivo
estndar:
En el caso de diarrea
aguda, el aislamiento
de Salmonellas,
Shigella,
Campylobacter o
Yersinia tiene que ser
siempre considerado
como significativo.

Coprocultivo
Procedimientos bsicos en la
toma de muestras biolgicas
para diagnstico.
Materia Fecal: La muestra de
materia fecal (diarreica,
pastosa o formada) debe ser
reciente (< de 24 hrs) Las
heces obtenidas del suelo,
excusado o paal no son
aceptadas por la
contaminacin ambiental a
que fueron expuestas

Coprocultivo
Procedimientos bsicos en la toma
de muestras biolgicas para
diagnstico.
Hisopo Rectal: Emplear este tipo de
muestra solamente en casos
sospechosos de etiologa
bacteriana.
Tomar la muestra introduciendo la
punta de un hisopo de algodn,
previamente humedecido en
solucin salina estril o medio de
transporte, en el recto y rotarlo
ligeramente. La presencia de un
ligero color caf en el hisopo
indica que la muestra ha sido bien
tomada. Introducir el hisopo con la
muestra hasta el fondo de un tubo
de tapn de rosca con medio de
transporte Cary-Blair.

Sistema de
Identificacin
Microbiana
BBL Crystal

Coprocultivo

Coprocultivo
Durante un brote, las muestras de heces o de
hisopados rectales deben obtenerse de
entre 10 y 20 personas que cumplan los
siguientes criterios:
Actualmente tienen diarrea acuosa (clera) o
diarrea sanguinolenta (disentera)
La enfermedad se inici menos de 4 das
antes del muestreo, y
No han recibido tratamiento antimicrobiano
para la enfermedad diarreica.
Las muestras de fecales se deben obtener en
los primeros estadios de cualquier
enfermedad entrica, cuando los agentes
patgenos estn por lo regular presentes en
las heces en su mayor nmero, y antes de
que el tratamiento antibitico se haya
iniciado. Una excepcin a esta regla es el
caso de las heces obtenidas de pacientes
con enfermedad febril: en el caso de fiebre
tifoidea, el agente etiolgico, Salmonella ser
typhi, puede estar presente en las heces,
en la mxima cantidad, en la segunda y
tercera semanas de la enfermedad.

Coprocultivo
Obtencin de muestra de heces
Las muestras de heces deben colectarse en
recipientes limpios, sin desinfectantes ni
residuos de detergentes, y con las tapas bien
cerradas y a prueba de derrames. Las
muestras no deben sacarse de paales, porque
pueden contener residuos de
desinfectantes u otros contaminantes. Las
muestras fecales no preservadas deben,
en lo posible, refrigerarse, y procesarse como
mximo 2 horas despus de haberlas
obtenido. Las muestras que no se pueden
cultivar en un plazo de 2 horas despus
de haberse obtenido, se deben colocar en
medio de transporte y refrigerar
inmediatamente.

Coprocultivo
Obtencin y transporte de muestras fecales para el diagnstico de laboratorio

Cundo se toma la muestra Cuando el paciente tiene diarrea, lo antes posible


luego del comienzo de la enfermedad (preferiblemente dentro de los cuatro primeros
das) y antes de comenzar el tratamiento con antimicrobianos.
Cunto se debe obtener Un hisopo rectal o aplicador de muestra fresca en un
medio de transporte.
Medio de transporte Cary-Blair u otro medio de transporte conveniente (NO debe
usarse glicerol salino de tampn para el transporte de muestras de V. cholerae).
Almacenamiento despus de la coleccin Refrigerar a 4C si los especmenes se
recibirn en el laboratorio antes de las 48 horas o congelar a -70C. Las muestras
fecales de pacientes con sospecha de tener clera pueden ser transportadas a
temperatura ambiente y mantenidas por largo tiempo si es necesario; sin embargo,
se prefiere la refrigeracin.
Transporte Tubos sellados o recipientes a prueba de prdidas; colocar en un
recipiente hermtico para proteger del hielo o hielo seco. Remitir en una caja aislada
con paquetes de congelacin, hielo o hielo seco, para entrega al da siguiente.

Coprocultivo
Medios de transporte para muestras fecales
Informacin relativa a los medios apropiados para el transporte de
muestras fecales que se sospecha contienen Shigella, Vibrio
cholerae o Salmonella (incluido el serotipo typhi). Una vez que las
muestras de un brote de enfermedad diarreica llegan al laboratorio,
los laboratoristas deben seguir los
procedimientos para el aislamiento de Shigella o V. cholerae, segn si
los informes recibidos indican que el brote parece ser disentera o
una enfermedad parecida al clera. Las personas de quienes se
sospecha que pueden tener tifoidea presentarn por lo regular
fiebre sin diarrea, por lo que los laboratorios no reciben
normalmente un gran nmero de muestras fecales durante los brotes
de tifoidea. Sin embargo, hay veces en que se pueden enviar
muestras fecales a un laboratorio para el diagnstico de infeccin
por S typhi

Coprocultivo

Colocacin de las heces en el


medio de transporte
Si es posible, enfre el medio de
transporte durante 1 a 2 horas en un
refrigerador o caja nevera antes de
utilizarlo. Se puede obtener una
pequea cantidad de heces insertando
en ellas un hisopo de punta de
algodn estril o de polister y
rotndolo. Si estn presentes mucus o
detritus del epitelio intestinal, tambin
debe obtenerse una muestra en el
hisopo. Para seguir el muestreo de las
heces en el hisopo:
a) Inserte inmediatamente el hisopo que
contiene material fecal dentro del
medio de transporte.
b) Empuje el hisopo completamente, hasta
el fondo del tubo del medio de
transporte.

Coprocultivo
c) Rompa la parte superior del palillo con los dedos
y deschelo.
d) Ponga nuevamente la tapa de rosca en el tubo
del medio de transporte y cirrela bien.
e) Coloque el tubo en el refrigerador o en la caja
nevera.

Coprocultivo
Obtencin de hisopados rectales
Algunas veces se obtienen hisopados rectales en lugar de muestras de heces. Los
hisopados rectales pueden obtenerse como sigue:
a) Humedezca el hisopo en medio de transporte estril.
b) Inserte el hisopo por el esfnter rectal 2 a 3 cm (1 a 1,5 pulgadas) y rtelo.
c) Saque el hisopo del esfnter rectal y examnelo para estar seguro de que hay material
fecal visible en el hisopo. (Si no, repita el procedimiento con el mismo hisopo.)
d) Inserte inmediatamente el hisopo en el medio de transporte en fro (como se describe
en la seccin anterior).
e) Ponga el tubo en un refrigerador o caja nevera.
El nmero de hisopos necesarios depender del nmero de placas a inocular.
En general, si las muestras se van a examinar para detectar la presencia de ms
de un agente patgeno, ser necesario obtener al menos dos hisopos con heces
o rectales por paciente, y ambos hisopos deben ser insertados dentro del mismo
tubo de medio de transporte. Una vez que el hisopo est colocado en el medio,
debe permanecer en el tubo hasta que sea procesado en el laboratorio.

Aislamiento y Cultivo de
Salmonellas
Al igual que el resto
de
Enterobacteriaceae,
S typhi es un bacilo
(bastn)
gramnegativo

Aislamiento y Cultivo de
Salmonellas
La bacteria Salmonella serotipo typhi (S. typhi), agente
etiolgico de la fiebre tifoidea, causa alrededor de 16,6
millones de casos y 600.000 muertes al ao en todo el
mundo. Los serotipos paratifodicos de Salmonella
causan un sndrome similar a la fiebre tifoidea. Los
aislamientos de los serotipos paratifodicos (por ejemplo,
S. paratyphi A, S. paratyphi B y S. paratyphi C) son
mucho menos frecuentes que los de S. typhi. En raras
ocasiones, otros serotipos de Salmonella, como S.
enteritidis, pueden tambin causar fiebre entrica.
Como otros patgenos entricos, las infecciones por S.
typhi se transmiten por los alimentos y el agua
contaminados con heces de personas con infeccin
aguda, excretores persistentes o portadores crnicos
asintomticos.

Aislamiento y Cultivo de
Salmonellas
Las Salmonellas se
pueden aislar en un
Agar Sangre, pero
por su importancia en
muestras clnicas se
han elaborado
diversos medios
diferenciales,
selectivos y altamente
selectivos.

Aislamiento y Cultivo de
Salmonellas
NORMA OFICIAL MEXICANA
NOM-114-SSA1-1994,
BIENES Y SERVICIOS.
MTODO PARA LA
DETERMINACIN DE
SALMONELLA EN
ALIMENTOS

Establece
6.1.2 Caldo de
enriquecimiento

Aislamiento y Cultivo de
Salmonellas
6.1.2.1 Caldo selenito-cistina
Frmula

Triptona o polipeptona 5,00 g

Lactosa 4,00 g

Fosfato disdico 10,00 g

Selenito cido de sodio 4,00 g

L-cistina 0,01 g

Agua destilada 1,00 l

pH final: 7,0 ; 0,2 a 25C


Preparacin

Disolver los ingredientes en un litro de agua


destilada estril y distribuir en volmenes de
10 y 225 ml en recipientes estriles, segn
se requiera.

El caldo as preparado es transparente. De


preferencia usarlo el mismo da de su
preparacin.

Si se desea conservar el medio por varios


das, puede exponerse al calor en autoclave
por 5 min a 110C, tomando entonces un
color salmn.

Aislamiento y Cultivo de
Salmonellas

Caldo de selenito (SEL)

El caldo de selenito (SEL) se utiliza


frecuentemente como un caldo de
enriquecimiento para Salmonella, incluida
S typhi.
Para cualquier laboratorio puede ser
ventajoso utilizar el SEL, porque
tambin puede utilizarse como
enriquecimiento para Shigella. El SEL
solamente debe ser incubado durante
1416horas a 35C37C. Despus de
la incubacin, el caldo de selenito
debe ser estriado en un medio de agar
selectivo (por ejemplo, EH o DXL).
Control de calidad: Despus de
enriquecer toda la noche en SEL,
Salmonella spp.
produce tpicamente un crecimiento de
bueno a excelente cuando es estriada
en agar MacConkey.

Aislamiento y Cultivo de
Salmonellas
6.1.2.2 Caldo tetrationato
Frmula
Ingredientes Cantidades Unidades

Proteosa peptona o triptona 5,0 g

Sales biliares 1,0 g

Carbonato de calcio 10,0 g

Tiosulfato de sodio pentahidratado 30,0 g

Agua destilada 1,0 l

pH final: 7,0 ; 0,1


Preparacin

Disolver los ingredientes en un litro de agua


destilada estril.

Distribuir, agitando constantemente, en


porciones de 10 y 225 ml, en recipientes
estriles. Guardar en refrigeracin.

Antes de usar el medio, agregar 2 ml de


una solucin yodo-yoduro y 1 ml de solucin
de verde brillante al 0,1% por cada 100 ml
de caldo. El medio una vez adicionado de
yodo no debe calentarse y debe usarse el
mismo da de su preparacin.

Aislamiento y Cultivo de
Salmonellas
8.2 Aislamiento de Salmonella
8.2.1 Cerrar firmemente el tapn de rosca de los matraces con los
cultivos de preenriquecimiento y agitar suavemente, transferir
respectivamente 1 ml de la mezcla a un tubo que contenga 10 ml
de caldo tetrationato y a otro con 10 ml de caldo selenito cistina.
Como alternativa, en sustitucin del caldo tetrationato puede
emplearse el medio Vassiliadis-Rappaport.
8.2.2 Incubar de 18 a 24 h a 35 C o, para alimentos fuertemente
contaminados a 42C por el mismo periodo. Estriar los productos
que fueron directamente enriquecidos en medios selectivos.
8.2.3 Mezclar el tubo con caldo selenito cistina y estriar en agar
xilosa lisina desoxicolato (XLD), agar verde brillante (VB) y una
tercera caja con cualquiera de los medios selectivos adicionales
(agar entrico Hektoen, agar Sulfito de Bismuto o Agar SS).
Efectuar el mismo procedimiento para el caldo tetrationato.
Incubar las placas 24 hrs; 2 h a 35C.

Aislamiento y Cultivo de
Salmonellas
8.2.4 Examinar las placas
para investigar la
presencia de colonias
tpicas de Salmonella, de
acuerdo con las
siguientes caractersticas:
Agar XLD: colonias rosas
o rojas que pueden ser
transparentes con o sin
centro negro. En algunos
casos las colonias
pueden aparecer
completamente negras.

Aislamiento y Cultivo de
Salmonellas
Agar VB: colonias
rojas o rosas que
pueden ser
transparentes
rodeadas por medio
enrojecido; las
bacterias
fermentadoras de la
lactosa dan colonias
amarillas.

Aislamiento y Cultivo de
Salmonellas
Agar entrico
Hektoen: colonias
verdes o azulverdes
con o sin centro
negro. En algunos
casos las colonias
pueden aparecer
completamente
negras.

Aislamiento y Cultivo de
Salmonellas
Agar Sulfito de Bismuto: las
colonias tpicas de Salmonella
pueden ser cafs, grises o
negras; con o sin brillo
metlico. Generalmente el
medio circundante (halo) es
caf, tornndose
posteriormente negro. Algunas
cepas producen colonias
verdes sin la formacin del
halo oscuro. Si las placas no
muestran colonias tpicas o no
se observa crecimiento,
incubar 24 h adicionales.

Aislamiento y Cultivo de
Salmonellas
Agar SS: colonias
translcidas,
ocasionalmente
opacas. Algunas
colonias dan centro
negro. Las colonias
fermentadoras de la
lactosa son rojas.

Aislamiento y Cultivo de
Salmonellas
8.3 Identificacin
bioqumica

Aislamiento y Cultivo de
Salmonellas
8.4 Identificacin
serolgica
8.4.1 Ensayo de los
antgenos somticos
de Salmonella
(Antisuero polivalente
O)

Aislamiento y Cultivo de
Salmonellas
Por lo tanto, si deseamos
hacer un buen
diagnstico bacteriolgico
para el aislamiento e
identificacin de bacterias
entero - patgenas
debemos utilizar los
medios de
enriquecimiento como
alternativas que nos
ofrecen resultados
efectivos.

Aislamiento y Cultivo de
Salmonellas
Algunos estudios de investigacin
describen un incremento en la
recuperacin de Salmonellas hasta de
un 700% con el uso de medios de
enriquecimiento

Aislamiento y Cultivo de
Shigellas
El sello distintivo de la infeccin por Shigella
es la diarrea con sangre, frecuentemente
conocida como disentera. Sin embargo, en
casi la mitad de los casos, las infecciones
por Shigella causan diarrea aguda no
sanguinolenta que no se puede distinguir
clnicamente de la diarrea causada por otros
agentes patgenos entricos

Aislamiento y Cultivo de
Vibrio
La mayora de los aislamientos de Vibrio
cholerae obtenidos durante brotes de clera
sern de los serogrupos toxignicos O1 u
O139.

Antibiograma

Coprocultivo

Coprocultivo

Gracias

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