UNIVERSIDAD NACIONAL JOSE

FAUSTINO SANCHEZ CARRION

BIOQUIMICA

ENZIMAS 2012 - II Parte

Mg. SOLEDAD LLAEZ BUSTAMANTE

HUACHO 2012

Los modelos de enzimas

A. Modelo de la llave y la
cerradura.E.F.1894
E.Fisher1894

B. Modelo del ajuste

inducido.D. K 1958

CINETICA ENZIMTICA

ECUACIN DE MICHAELISMENTEN
Vo = Vmax [S]
Km + [S]

Este modelo cintico adopta la hiptesis del estado estacionario,

segn la cual la concentracin del complejo enzima-sustrato es
pequea y constante a lo largo de la reaccin
v = k3 [ES] = constante
OV. Estado estacionario = Estado de equilibrio de sus reacciones . La
concentracin de los intermediarios permanece mientras que la
concentracin de los materiales de partida y productos van
cambiando La velocidad cataltica es igual a la concentracin del
complejo ES y K3

DETERMINACIN DE KM Y Vmax
MEDIANTE UNA ECUACION LINEAL
Se tiene:
vo= Vmax*[S]
Km + [S]
Se factoriza 1 =
vo
Se simplifica:

se invierte 1 = Km + [S]
vo Vmax*[S]

Km
* 1
+
[S]
Vmax
[S]
Vmax[S]

1 = Km
* 1
+
vo
Vmax
[S]

y=a*x+b

1
Vmax

TRANSFORMACIN DE LOS DOBLES RECPROCOS

(LINEWEAVER-BURK)

NIDAD DE ACTIVIDAD ENZIMTICA (U):

La UIB - EC : Unidad de mol/seg, en vez de

umol /min, a 25 0C, en las condiciones de
medida ptima. Tambin es comn el uso de
Katal ,mKtal,uKtal nkatal, pKatal)
CTIVIDAD ESPECFICA:

el N de U de una E / mg de protena.
decir: una medida de la pureza de la E.
purificarla, el valor llega a un mximo y es estable.

MERO DE RECAMBIO
No. de molculas de S transformadas /unidad de
tiempo, por una molcula de E ( o por un solo sitio
cataltico)
Enzima
No. de
Recambio
Anhidrasa carbnica
36 000 000
B-Amilasa
1 000 000
B-Galactosidasa
12 000
Fosfoglucomutasa
1 240

Catalasa
000
Citrocomo c, a 38 C
Carboxilasa a 30 C

2,5 00
1.4 X 103
1x10 3

Este nmero de recambio, en

algunas ocasiones, es muy elevado,
como sucede con la catalasa que a 0
C., tiene un nmero de recambio de
2.5 millones; es decir, un mol de
enzima es capaz, en un minuto, de

La KM es un parmetro de
Actividad Enzimtica
La KM es inversamente
proporcional con la actividad de
la enzima.
Valor de KM grande, baja
actividad
Valor de KM pequeo, alta
actividad
los valores de esta constante,

Km de algunas enzimas
ENZIMA

SUSTRATO

Km (mM)

Catalasa

H2O2

25.0

Hexoquinasa

ATP

0.4

Anhidrasa carbnica
Quimotripsina

D-Glucosa

0.05

D-Fructosa

1.5

HCO3

Gliciltirosinilglicina

N-Benzoiltirosinamida
-Galactosidasa

9.0
108.0
2.5

D-Lactosa

4.0

Treonina deshidrogenasa L-Treonina

5.0

Isoenzimas o Isozimas
Son formas moleculares diferentes de una misma enzima
Catalizan la misma reaccin
Ejemplo: Lactato deshidrogenasa
Lactato + NAD ==== Piruvato + NADH
M 4 , M 3 H 1 , M 2 H 2, M 1 H 3 y H 4
Se diferencian por su movilidad electrofortica
Usadas en clnica: sueros normales y sueros con alguna patologa
Las ISOENZIMAS poseen diferentes KM, aunque catalicen la
misma reaccin.

Caso : Alcohol DH
AcetDH en Japoneses y Chinos
Etanol Acetaldehido. Aceton ( hep .Mitocondrial)
Asiticos Isoenzima (Hep citopl )de mayor Km. Aumenta la
sensibilidad al alcohol

Significado de la constante Vmax

1. Velocidad asinttica para s
2. Directamente proporcional a la concentracin de
enzima (hoy se prefiere caracterizar a la enzima
por k3)
3. Mide funcin de transformacin cataltica
4. Se expresa en unidades de velocidad

EFICIENCIA CATALTICA DE LAS ENZIMAS Kcat/Km

1. Valor elevado del Kcat/Km de una E = Gran

Capacidad de transformacin del S en P y una
elevada afinidad por el S
2. Mayor eficacia con un elevado valor del cociente
Kcat/Km
ENZIMA SUSTRA Kcat(S Km
-1
TO
)
(M)
Fumaras Fumarat
a
o
Malato

8x102
9x102

Kcat/Km M1
S-1

5x10-6 1.6x108
2.5x1 3.6x107
0-5

Mtodos de linealizacin
para determinacin
parmetros cinticos
Mtodo

Eje Y

Eje X

Intercepto Intercepto Pendiente

Eje Y
Eje x

Lineweaver
-Burke

1/v

1/s

1/V

-1/K

K/V

Hanes

s/v

K/V

-K

1/V

EadieHofstee

v/s

V/K

-K

Cuantificacin AE por Espectrofotometra

1. Forma ms rpida para cuantificar la AE
2. S o P es coloreado o absorbe la luz en el UV:
Aparicin o desaparicin de uno de ellos que
absorbe la luz es seguido por el espectrofotmetro
Ejm. Deshidrogenasa alcohlica que transfiere electrones del alcohol etlico

NAD

+
para formar NADH+H que absorbe luz UV en 340nm mientras que alcohol, NAD y el
acetaldehdo, no absorben. Se incrementara Abs. de Luz

Se puede usar un sistema de Rx. Acoplada a DH para

las q no absorven Luz y es necesario la presencia
de la coenz NAD + o NADP +.

Factores que contribuyen

Eficacia cataltica
1. Proximidad y orientacin del sustrato:
Orientacin Orbital
2. Catlisis Covalente
3. Catlisis Acido bsica (General y
especifica )
4. Factor de tensin en la catlisis enzimtica:
Relacin de la conformacin de la enzima y
la Actividad Cataltica

1. Proximidad y orientacin del sustrato : Orientacin

Orbital

Bruice: Hidrlisis de esteres

monofenilicos (Ac.
Dicarboxilicos)
Catalizador
CARBOXILATO LIBRE
Storm y Koshland:
Orientacin del S y
grupo cataltico del E
orbitales alineados
..ES

Catlisis Covalente

El objetivo es formar el intermediario covalente el mismo que rebaja

la barrera de energa de activacin de los implicados en la
transferencia de grupos

Catlisis Covalente (Base de SHIFF)

Aldolasa

3. Catlisis Acido bsica

especifica)

( General y

LISOZIMA

Mecanismo de accin cataltica de la LISOZIMA

Hidrlisis D Y E c-1 NAM con c-4 del NAG

Mecanismo de accin de la Lisozima

En principio la enzima se une a la molcula de glcido en

conformacin "silla" (a), que luego pasa a otra forma (b) al formar el
complejo ES. En el estado de transicin, acta un resto glutmico del
Sitio Activo de la enzima, que genera un carbocatin en el anillo D,

4.- Factor de tensin en la catlisis enzimtica: Relacin de

conformacin
del Enzima y la Actividad Cataltica

A qu grupo
corresponden?

Factor de

Factores que afectan la

velocidad
TIEMPO

CONCENTRACION DE
REACTANTES

PRESENCIA DE
INHIBIDORES/
CATALIZADORES

pH del
medio

TEMPERATURA

INFLUENCIA DE LA
TEMPERATURA
ENERGIA

MOLECULAS

MOLECULAS
COLISIONANDO Y
PRODUCIENDO UN
VALOR ELEVADO
DE ENERGIA

MOLECULAS
EN ESTADO DE PRODUCTO
TRANSICION

 Efecto de la Temperatura

T ptima
100-% Act. Mxima

Desnaturalizacin

37C

FACTORES QUE AFECTAN LA VELOCIDAD

ENZIMATICA

AE

El pH

pH

pH

Enzima

Vo

7
pH

11

14

pH ptimo

Pepsina 1.5
Tripsina 7.7
Catalasa
7.6
Arginasa
9.7
Fumarasa
7.8
Ribonucleasa 7.8

 Efecto del tiempo de Incubacin

Producto formado

TI

Efecto de la (E) sobre la velocidad de

Rx
Enzimtica

(E)
&
Vo

Vo

(E)

Efecto de los Catalizadores

Sustancias que en pequeas cantidades modifican la
velocidad de reaccin, acelerando (CAT. +) o retardando
(CAT. -), a ste ltimo tambin se le llama Inhibidor.
Con inhibidor
Energa
KCal

Sin catalizador
Con catalizador

C+D

Avance de la Rx

INHIBICIONES ENZIMATICAS

Inhibidores
Reactivos qumicos especficos que pueden
inhibir a la mayor parte de las enzimas.
Irreversibles
INHIBIDORES
Reversibles

Inhibidor Irreversible
Inhibicin permanente
Unin irreversible por medio de enlaces covalentes.
Modificaciones qumicas de los gps. catalticos.
Modificada la enzima, est siempre inhibida.
Para distinguirlo de los reversible se someten a
dilisis y si no se separan enzima e inhibidor, ste es
permanente.

Inhibidor Irreversible
Fluorofosfato de diisopropilo
(DFP)
Acetilcolina

Acetilcolinesterasa

Acetato + Colina

Inhibidor Irreversible
Fluorofosfato de diisopropilo
(DFP)

Acetilcolinesterasa
Tripsina
Elastasa
Fosfoglucomutasa
Cocoonasa (larvas de
gusanos de seda
Malatin

Inhibidor Reversible
La unin del inhibidor y la enzima es
reversible.
Al quitar el inhibidor del medio, se recupera la
actividad.
Hay 3 tipos:
Competitiva
No Competitiva
Acompetitiva (Alostrica)

Antibiticos
Insecticidas
Herbicidas
Venenos
Diferentes Medicamentos

Inhibicin
enzimtica

Dolor
Inflamacin
Infecciones virales
Cncer

Inhibidores Competitivos
Compiten con el sustrato por el
sitio activo de la enzima
Se une solo a la enzima libre
V mx no se altera y K M cambia

Inhibicin Competitiva

S
E

ES

E+P

I
EI

Se define una constante de

equilibrio de disociacin del
inhibidor:

[E] [I]
Ki =
[EI]

Caractersticas:
- Las fijaciones de substrato e inhibidor son mutuamente exclusivas
- A muy altas concentraciones de substrato desaparece la inhibicin
- Por lo general, el inhibidor competitivo es un anlogo qumico del
substrato.
- El inhibidor es tan especfico como el substrato

Inhibicin competitiva - Representacin recproca

doble
1/v

0.07
0.06
0.05
0.04

1/Vmax

0.03
0.02

-1/Km

0.01

1/s

0.00
-0.3

-0.2

-0.1

0.0

0.1

0.2

-1/(Km(1 + i/Ki))

0.3

0.4

0.5

0.6

Ejemplo Inhibidor
Competitivo
cido succnico + FAD = cido fumrico
+ FADH2
El inhibidor competitivo es el cido
malnico
Es un anlogo estructuralmente al
cido succnico

cido Flico y Sulfanilamida

La sulfanilamida es un anlogo
estructural del cido p aminobenzoico (PABA)
PABA es el punto de partida para la
sntesis de cido flico en las bacterias
El cido flico es una vitamina esencial
para la proliferacin (divisin)
bacteriana
Sulfanilamida se usa en el
tratamiento algunas infecciones

METOTREXATO Y DIHIDROFOLATO
El cido flico en sus formas de
dihidro y tetrahidrofolato es coenzima
de la reaccin catalizada por la
dihidrofolato reductasa
Esta reaccin es parte del
metabolismo de los nucletidos para
la sntesis de DNA
Metotrexato se usa en la terapia de
algunos cnceres, inhibiendo la

Inhibidor competitivo
su estructura es similar a la del sustrato

Noseformaproducto

Inhibidores Competitivos

Malonato Deshidrogenasa del cido succnico

Sulfas

Infecciones microbianas

Captopril y Enalopril
Alopurinol
Fluoruracilo

Antihipertensores

Controla la gota
Cncer

Inhibidor No Competitivo
Se une a un lugar diferente del sitio
activo la enzima
Se une a la enzima libre y tambin al
complejo enzima-sustrato
Por accin del inhibidor disminuye la
Vm pero el valor de Km no se altera

Inhibidor NO competitivo
El inhibidor NO competitivo se une a la enzima
en un sitio diferente del sitio activo

S
E

ES

Inhibicin
No Competitiva

S
EI

E+P

ESI

El inhibidor se fija indistintamente a la enzima libre E

y al complejo enzima-substrato ES; ni el complejo EI
ni el complejo ESI son productivos

Inhibicin No Competitiva
El inhibidor NO se une al sitio activo

NO se puede revertir con un exceso de sustrato

Inhibicin acompetitiva
El inhibidor se une a una SUBUNIDAD reguladora

La subunidad cataltica
une al sustrato y
cataliza la reaccin

Inhibidor Incompetitivo
En este tipo de inhibicin el inhibidor se enlaza al
centro activo pero solo despus de que el sustrato lo
haya hecho y, por tanto, inhibidor y sustrato no
compiten. De esta manera, aunque todo el sustrato
est saturando la enzima y toda la enzima est
como complejo ES, el inhibidor puede enlazarse
produciendo un complejo inactivo ESI.
Como I solo se une a ES estimula la formacin de
ES y, por tanto, incrementa la unin del sustrato a la
enzima, disminuyendo Km . Sin embargo, el
complejo ESI no conduce a productos y Vm
disminuye.

Inhibidor Incompetitivo
Se une a un lugar diferente del sitio
activo de la enzima
Se une slo al complejo enzimasustrato
Los efectos que tiene: disminuye el
valor de Km y tambin el de Vmx

S
E

ES
ESI

E+P
Inhibicin
Anticompetitiva

El inhibidor slo puede fijarse al complejo ES;

el complejo ESI no es productivo

Determinacin de parmetros cinticos

de inhibicin
Modelo
Inh comp
Inh no comp total
Inh anticomp

Kap

Vap

Km(1+i/Ki)

Vm

Km

Vm/(1+i/Ki)

Km/(1+i/Ki)

Vm/(1+i/Ki)

Mecanismo de ping-pong para una reaccin enzimtica.

La unin de los sustratos A y B tiene lugar en un orden
definido y secuencial, por medio de un intermediario
enzimtico modificado, E*. Entre las enzimas con este
tipo de mecanismo podemos encontrar alguna
oxidorreductasa, como la tiorredoxima peroxidasa,
transferasas, como la acil-neuraminato citidil transferasa,
y serin proteasas, como la tripsina y la quimiotripsina.
Las serin-proteasas conforman una diversa familia de
enzimas muy comunes, que incluyen enzimas digestivas
(tripsina, quimiotripsina y elastasa), varias enzimas del
proceso de coagulacin y muchas otras. En las serin-

Enzimas Alostricas
Son enzimas cuya estructura proteica est
formada de varias subunidades
No se rigen por la cintica de M - M
Adems del sitio o centro activo tienen
sitios alostricos o de regulacin
Sitio activo/sustratos;
Sitio alostrico/moduladores o reguladores
La relacin entre la velocidad de reaccin
y la concentracin de sustrato sigue
cintica sigmodea

Enzimas alostricas
Las
enzimas
alostricas
presentan
estructura
cuaternaria.
Tienen
diferentes
sitios activos, unen
mas
de
una
molcula
de
sustrato
La
unin
del
sustrato
es
cooperativa

Concepto de
Cooperatividad
La unin de los sustratos al sitio activo
de una subunidad produce un cambio
conformacional que por contacto fsico
se transmite a las subunidades vecinas,
facilitando las interacciones
Modelos de unin: secuencial y
concertado
unin
Hb-O2,
enzimas
Ejemplos:
alostricas y sus sustratos

Moduladores Alostricos
Tambin reciben el nombre de
efectores y pueden ser positivos o
negativos
Se unen al sitio alostrico que puede
estar en la misma subunidad que
tiene al sitio activo o en las
subunidades regulatorias
Su unin produce un cambio
conformacional que afecta al sitio
activo

Las Isoenzimas o isozimas

Tienen secuencias de aminocidos semejantes
pero no idnticas.
Todas las formas presentan actividad enzimtica y
catalizan la misma reaccin bioqumica, pero
pueden diferenciarse por tener distintas propiedades
cintica (diferente KM y Vmax), reguladoras (diferentes
efectores); preferencias por las coenzimas, incluso
por su distribucin celular

FIN