ADN Recombinante

ADN recombinante es una molcula que proviene

de la unin artificial de dos fragmentos de ADN.
Por lo tanto, la tecnologa de ADN recombinante
es el conjunto de tcnicas que permiten aislar un gen
de un organismo, para su posterior manipulacin e
insercin en otro diferente.
De esta manera podemos hacer que un organismo
(animal, vegetal, bacteria, hongo) o un virus
produzca una protena que le sea totalmente extraa

ADN
Recombinante

Estas tcnicas se emplean normalmente para la

produccin de protenas en gran escala, ya que

podemos hacer que una bacteria produzca una
protena humana y lograr una superproduccin,
como en el caso de la insulina humana, que
actualmente es producida por bacterias en
grandes recipientes de cultivo, denominados
biorreactores. Como las bacterias se multiplican
muy rpidamente y pueden expresar grandes
cantidades de protenas, es posible lograr una
sobreproduccin de la protena deseada.
A esto justamente se dedica la biotecnologa,
es decir a la utilizacin de organismos vivos o de
sus productos con fines prcticos.

El desarrollo de la tecnologa del ADN

recombinante fue posible gracias a varias
lneas de investigacin:

1. El conocimiento de las enzimas de

restriccin
2. La replicacin y reparacin de ADN
3. La replicacin de virus y plsmidos
4. La sntesis qumica de secuencias de
nucletidos

Tijeras moleculares: enzimas de restriccin

En 1975 Daniel Nathans y Hamilton O. Smith descubrieron

un tipo de protenas las enzimas endonucleasas o enzimas

de restriccin- que actan como tijeras moleculares,
cortando la doble cadena de ADN a travs del esqueleto de
fosfatos sin daar las bases. El descubrimiento de estas
enzimas condujo a dichos microbilogos al Nobel en 1978 y dio
origen a la ingeniera gentica.

Daniel Nathans

Hamilton O. Smith

Tijeras moleculares: enzimas de

restriccin

Las enzimas de restriccin son producidas

por bacterias como mtodo de defensa

contra virus y degradan el ADN extrao.
A su vez, el propio genoma bacteriano
est protegido contra sus enzimas de
restriccin mediante metilaciones (es
decir, el agregado de un grupo metilo [CH3)]) en un tomo especfico de ciertos
nucletidos.
Estas molculas son indispensables para
la ingeniera gentica, ya que producen
fragmentos que se pueden unir entre s
fcilmente (con la ayuda de la enzima
ligasa).
Las enzimas de restriccin cortan dejando
extremos cohesivos . Generados cuando la
enzima corta las dos hebras
asimtricamente, dejando los extremos de
cada hebra de simple cadena
complementarios entre s.

Vemoslo grficamente para hacernos una

idea ms clara:

Cmo introducir ADN recombinante en las bacterias?

Una vez que se supo cmo fabricar ADN recombinante

usando enzimas de restriccin y ligasas, el desafo

siguiente fue cmo producir grandes cantidades de
genes y cmo introducirlos en bacterias u otras clulas
husped.
El primer problema fue solucionado con el uso de
plsmidos, pequeas molculas de ADN circular
presente en muchas bacterias.
Los plsmidos contienen uno o ms genes de resistencia
a antibiticos y son capaces de autorreplicarse, ya que
contienen una secuencia de iniciacin. Esto les permite
replicarse de manera independiente del ADN genmico

Cmo introducir ADN recombinante en

las bacterias?
1.
1. Cortamos
Cortamos el
el ADN
ADN circular
circular del
del

2.
2.

3.
3.

4.
4.

plsmido
plsmido con
con enzimas
enzimas de
de
restriccin,
para
generar
restriccin, para generar
extremos
extremos cohesivos.
cohesivos.
Cortamos
Cortamos el
el ADN
ADN que
que queremos
queremos
multiplicar.
Debemos
multiplicar. Debemos
asegurarnos
asegurarnos de
de que
que los
los extremos
extremos
del
plsmido
y
los
del
ADN
del plsmido y los del ADN a
a
insertar
sean
complementarios
insertar sean complementarios y
y
puedan
unirse.
puedan unirse.
Unimos
Unimos el
el gen
gen que
que queremos
queremos
introducir
introducir (inserto)
(inserto) por
por medio
medio de
de
la
la enzima
enzima ADN-ligasa
ADN-ligasa y
y luego
luego
introducimos
introducimos el
el plsmido
plsmido con
con
inserto
inserto en
en bacterias.
bacterias.
Seleccionamos
Seleccionamos las
las bacterias
bacterias que
que
hayan
introducido
el
plsmido
hayan introducido el plsmido
con
con la
la ayuda
ayuda de
de antibiticos.
antibiticos.
Dado
que
los
plsmidos
Dado que los plsmidos
contienen
contienen un
un gen
gen de
de resistencia
resistencia
a
antibitico,
al
exponer
a antibitico, al exponer las
las
bacterias
a
ese
antibitico,
bacterias a ese antibitico, slo
slo
las
las que
que hayan
hayan incorporado
incorporado el
el
plsmido
plsmido (y
(y con
con l
l la
la resistencia)
resistencia)
sobrevivirn,
sobrevivirn, mientras
mientras que
que las
las
que
que no
no lo
lo tengan
tengan morirn.
morirn.

Cmo
Cmo introducir
introducir ADN
ADN recombinante
recombinante en
en las
las bacterias?
bacterias?

Esta es una manera relativamente eficaz de obtener millones

de copias del ADN incorporado.
Dado que todas las copias del gen provienen de una sola
molcula multiplicada a partir de una nica bacteria que dio
origen a la colonia, esta tcnica lleva el nombre de clonacin.
El trmino clon proviene de la jardinera; desde hace siglos los
jardineros generan plantas nuevas a partir de gajos. Estas
plantas son genticamente idnticas y constituyen un clon.
Un clon es un grupo de clulas u organismos genticamente
idnticas.
El uso fragmentos de ADN como vectores cumple un rol
fundamental en la ingeniera gentica, ya que sirven para
transferir material gentico de un organismo a otro.
Vector: cualquier organismo o virus capaz de mover genes de
un organismo a otro

Cmo amplificar el
cadena de la

ADN? Reaccin en
polimerasa

Durante las dcadas de 1970-1980, la manera ms prctica de

hacer mltiples copias de una secuencia particular de ADN era

introduciendo una molcula de ADN recombinante (un plsmido
ms un gen) en una clula husped. Esto poda resultar un poco
engorroso, ya que muchas veces se dispona de una cantidad muy
pequea de m A mediados de la dcada de los 80, la invencin de
una tcnica capaz de generar centenares de miles de copias de una
secuencia sin la necesidad de clonarla en ningn tipo de vector
resolvi este problema.
Kary Mullis, un bioqumico americano que trabajaba sintetizando

ADN, resolvi este problema con la invencin de la reaccin en

cadena
de la polimerasa molculas de ADN para realizar pruebas

Cmo
Cmo amplificar
amplificar el
el ADN?
ADN? Reaccin
Reaccin en
en cadena
cadena de
de la
la Polimerasa
Polimerasa

Cmo amplificar el ADN? Reaccin en cadena de la

polimerasa
Esto la convierte en una importante, si no imprescindible,

herramienta para el anlisis de filiacin o de criminalstica forense, ya

que con slo una pequesima muestra se pueden realizar diferentes
estudios comparativos que nos permiten conocer el dueo de un
rastro gentico en particular.
Tambin se usa para el desarrollo de nuevas estrategias de
diagnstico mdico, como la deteccin de virus o de mutaciones que
provocan enfermedades genticas, a partir de una muestra de ADN
tan pequea como un cabello o una gota de sangre.
Otra aplicacin de la tcnica de la reaccin en cadena de la
polimerasa es la transcripcin inversa de ARNm. Mediante el uso de
una enzima de origen viral denominada transcriptasa reversa puede
usarse como molde una molcula de ARNm, transcribirla a una
secuencia de ADN, y luego ser amplificada como cualquier otra
secuencia por la reaccin en cadena de la polimerasa, con lo que se
obtiene una gran cantidad de ADN a partir de unas pocas molculas
de ARNm. Esta tcnica es muy empleada para el estudio de expresin
gnica, as como para la produccin de protenas en diferentes
organismos.

Cmo encontrar el gen adecuado? Imanes biolgicos: sondas y

anticuerpos

Hasta hace relativamente poco, encontrar un gen en un

genoma era como encontrar una aguja en un pajar. Si

tuviramos que realizar dicha tarea, probablemente
usaramos un imn para atraer la aguja (siempre y cuando
esta sea de metal y posea propiedades magnticas). De
manera anloga, hoy da podemos encontrar genes o
protenas usando, respectivamente, sondas y anticuerpos,
que actan como imanes moleculares.

Las sondas son fragmentos de ADN o ARN de simple

cadena complementarias a la regin de ADN o ARN que

queremos encontrar. Contienen alguna marca que permite
revelar su unin (hibridacin) a la secuencia elegida y de
esa manera revela presencia de la regin buscada.

Cmo se marcan esas sondas o

fragmentos de cidos nucleicos?
Una de las tcnicas ms empleadas

para localizar fragmentos

determinados del genoma (o la
expresin de algn gen en
particular por medio de la deteccin
de la presencia de su
correspondiente ARNm) es la
hibridacin in situ

 Durante este proceso se incuba

el ADN con una sonda (de ADN

o ARN) complementaria a la
secuencia buscada, y marcada
radiactiva o qumicamente.
La sonda navega por el
interior de la clula hasta
encontrar una secuencia
complementaria a ella.
Una vez que esto ocurra se
formar una doble cadena que
permitir no slo detectar la
presencia de esta secuencia,
sino indicar el lugar especfico
que ocupa dentro de la clula.
Si se tratara de un fragmento
de un cromosoma, nos
permitira saber su localizacin
exacta o locus.

Para revelar la presencia de

hibridacin de la sonda, la
muestra debe exponerse a una
placa radiogrfica; en el caso de
las sondas marcadas
qumicamente se procede a su
revelado mediante el uso de
molculas fluorescentes o que
puedan ser detectadas por
colorimetra (utilizando una
enzima que provoque el cambio

Cmo estudiar la expresin de diversos genes?

Si visitamos un laboratorio de biologa molecular,

probablemente encontraremos una cuba con un gel al cual

se le aplica una corriente elctrica. Este mtodo, llamado
electroforesis en gel, es muy usado para separar
molculas de diversos tamaos y es la base de las tcnicas
que describiremos para identificar ADN, ARN, y protenas.
En los prrafos siguientes describiremos entonces la
electroforesis para poder comprender luego cmo funcionan
las dems tcnicas.

La electroforesis en gel es uno de los mtodos ms

utilizados en los laboratorios para separar cidos nucleicos o

protenas, de acuerdo con su tamao.

Electroforesis en gel

Cmo estudiar la expresin de diversos genes?

Southern, Northern y Western Blot

Existen diferentes tcnicas que emplean la

separacin en gel por electroforesis que

acabamos de ver como primer paso para
identificar la presencia de determinadas
molculas dentro de una muestra. Una de ellas
fue inventada por Edward M. Southern en 1975
para la deteccin de ADN.
Como por ejemplo la Northern Blot, que consiste
en que una vez finalizada la corrida en el gel,

se realiza la transferencia (o blotting) de las

muestras a una membrana para su posterior
revelado

Northern Blot
Luego se utilizo
el mismo
sistema para el
ARN y se le
denomin
Northern Blot

Estas dos tcnicas persiguen fines distintos: el

Southern Blot, que detecta la presencia de ciertas
secuencias en el ADN, se usa, por ejemplo, para
estudiar mutaciones en el genoma.
El Northern, en cambio, permite detectar qu genes
son transcriptos en determinadas condiciones.
Hemos visto que dos clulas del mismo organismo
se distinguen por los genes que expresan y no por
su ADN.

Si luego queremos detectar protenas, usaremos otra

tcnica similar: el Western Blot, que deriva de la
electroforesis en gel y separa protenas mediante la
utilizacin de anticuerpos especficos.

Cmo sacar fotos de genes activados? Microarreglos

Los ensayos con
microarreglos son rpidos
de realizar, pero muy
engorrosos de analizar.
Adems, estn muy
limitados a los genes que
ya se conocen. Permiten
obtener un pantallazo
rpido sobre qu est
pasando en la clula en
ese momento
determinado, en cuanto a
qu genes estn
encendidos y cules
apagados. Sin embargo,
los resultados obtenidos
nunca deberan ser
concluyentes, sino que
tendran que ser validados